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标题: CIK加液后产生絮状物，大家来分析一下原因！！！ [打印本页]

作者: lyj-0017 时间: 2013-6-30 23:58 标题: CIK加液后产生絮状物，大家来分析一下原因！！！

CIK细胞起始阶段生长良好，细胞集落较多，但是在加液之后，细胞集落变大，并且聚团较大且有部分集落贴壁，后续培养过程中便会发现培养袋中出现絮状物，以至于后续培养过程中一直存在絮状物，细胞也死亡较多，不知道大家有没有遇到过这种情况？是我加液的问题还是别的什么原因导致的呢？

作者: jenvy121 时间: 2013-7-1 09:34

你的液体是否为无血清培养体系？如加了血浆，血浆是否灭活？血浆里面未灭活的补体可能会对细胞的生产产生此类作用。
如是无血清培养体系，那么培养液使用前是否预热，会不会是低温产生的应激导致细胞出现此类状况。

作者: 三月桂花香 时间: 2013-7-1 09:52

操作过程中是否被污染了？或者你的培养基是否被污染，絮状物是不是真菌类污染可能性大》？

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-1 12:36

回复 jenvy121 的帖子
, P7 R$ g3 ^/ d8 b! ^
我们用的是无血清培养基，培养基在使用之前是放在室温下平衡，但是室内是开的空调，温度也就23度，我也怀疑是温度的问题。
至于你说的预热培养基，应该是放在37度孵箱中还是37度水浴中呢？我曾经把培养基放在37度孵箱中，但是拿出来之后发现培养基颜色太紫，应该就是培养基pH值偏碱了吧，这样也会对细胞生长不利吧？不知道你们是如何预热的呢？

作者: 流泪的鱼 时间: 2013-7-1 13:40

先排除污染，如果倒置相差显微镜下观察团块是树枝状的，就是真菌污染。培养基是第二天变黄，非常黄就是细菌污染。也可以去培养液送到医院的检验科，做细菌培养和真菌培养。
如果不是污染，就是死细胞，死细胞会释放DNA，缠绕其他细胞，形成团块。那么，在判断细胞是如何死的。是不是操作不当？是不是换了新牌子培养基？是不是温度和CO2的问题？细节很多，你要一一排除。

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-1 13:41

回复三月桂花香的帖子
+ f9 u$ `* {( c2 \* }1 ~
不像被污染的样子啊，等我上图

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-1 13:49

回复 lyj-0017 的帖子
4 f" p. A9 z2 n* ?1 p5 ]
一个解释是，细胞受细胞因子刺激过度，有些患者的细胞不太能耐受细胞因子刺激
还一个解释是，自体血浆没有灭活

还有，培养基预热的话，可以扔培养箱也可以水浴，不过我不太建议用37℃，25℃就可以，我个人的经验是觉得37℃对培养基里的成分损失比较大0 v) y( l* A6 L! G

以上都是个人意见，望有高手点评

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-1 19:28

回复流泪的鱼的帖子1 ?; x! ]! b& W3 C

现在来看的话，可以排除污染，我还是能够分辨清楚是否发生污染的。% L1 E& d1 ]( ]4 x- F
所以现在认为是细胞死亡，具体原因还需要进一步排查。培养基一直是没有改变，CO2和孵箱温度也不会有问题；至于别的不当操作嘛，我现在认为有两种可能，一个是培养基温度，一个是添加的细胞因子浓度，还有别的因素不？请帮忙提供参考一下，多谢啦~

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-1 19:34

回复 sunny.yc 的帖子7 g9 f. w: D; B" U$ ~
% s) i9 O3 V6 u/ N" q" N* ~
我现在也怀疑是细胞因子的问题，可能对于有的病人过高，因为前面的病人养得也还是不错的，你认为哪种因子的浓度过高会对细胞不利呢？IFN-r? OKT3?抑或是IL-2？
培养基预热这个问题，我赞同你的说法，但是，我发现，将培养基放在孵箱中预热，培养基颜色会变紫，这是否意味着培养基pH值偏碱了呢？这时，培养基温度倒是提高了，但是pH值也同样升高了，这对细胞也同样不利吧？
用水浴是不是会更好一些呢？

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-1 19:50

上两张图片，大家看看再分析一下

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-2 10:35

回复 lyj-0017 的帖子; e. L8 e/ Y0 b/ }& \
1 C n& _& l" [& J7 E5 m7 t+ {/ X9 z
如果实验室有HH-1的水浴锅，那1L的培养基瓶子正好可以放进去，培养箱不太好，因为培养基瓶子也不一定干净，你不能保证你的冰箱就完全无菌吧，如果带进培养箱反而不好，弄不好污染了培养箱里的细胞，而且水浴锅水导热也比空气快，所以还是水浴锅吧。
培养基变紫这个问题，在培养箱或水浴锅都是一样的，因为你都是瓶盖拧上的，所以，没啥区别，再说培养基也是个缓冲体系，酸碱度变化不会很大的。

还有，我觉得，有可能是IL-2，最近翻了一下Rosenberg主编的《癌症生物治疗——原理与实践》，里面有几句话对IL-2的描述是这样的——鼠剔除IL-2后，可使T细胞过度且无法控制地增值，因而提示IL-2不是T细胞在体内生长的必须因子，而是T细胞凋亡所必需。

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-2 23:15

回复 sunny.yc 的帖子

预热这个问题，我发现水浴应该是比放在培养箱中要好一些，至少培养基pH值没发现有什么明显变化。你说的培养基瓶也可能将细菌带入培养箱中不是没有可能，应该注意！) n! b; L. L2 `: W$ a/ H

对于CIK的扩增来讲，anti-CD3单抗和IL-2是必需的，IFN-r和IL-1可增强CIK的细胞裂解毒性。所以我认为出问题的可能是前二者，不知道你们用的终浓度是多少呢，我们的分别是100ng/ml和2000U/ml，你觉得浓度高吗？

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-3 09:28

回复 lyj-0017 的帖子! Z- L+ u+ K+ h0 P: s

你试一下100ng/ml和1000U/ml吧，2000U/ml的IL-2实在是有点高了，大多都是300U到1000U，2000U我也是第一次听说- s- g# N2 C! A' ~
& u0 [5 s, f# u: Z0 ]8 q B2 T
不过，如果你现在才更改浓度，对于这份细胞来说，我觉得意义已经不大了，不过在对以后的实验肯定是有帮助的，2000U/ml，有点太高了

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-3 09:32

回复 sunny.yc 的帖子5 }1 Z/ j# [# e$ S5 q' G* ]: X' X
/ M8 e9 b! I: S# r
还有就是，CD3单抗也只是前期才用到，所以，对于之后的扩增影响不是太大，而且单抗一般都是作为前期一次刺激就可以了

你不会一直在添加单抗吧，呵呵

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-3 19:13

回复 sunny.yc 的帖子
2 _$ n$ Q- J! N9 b) B5 a
我们用的IL-2是国产的临床注射级别的，国产的一般效价一般都比较低一些吧，你们用的是国产还是进口的IL-2呢？国产的用2000也算高的了吗？# n+ w9 G9 q( h. @& R" [
anti-CD3单抗只是前期加，后期也是不加的。# _, i: Y0 u+ e3 h! z0 L# W
目前来看，可能就是这两种因子的浓度过高吧

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-4 21:58

回复 lyj-0017 的帖子

IL-2基本上都是用临床级的，试剂级的太贵了
IL-2你先试一下1000吧，基本上都是这个使用量的

CD3单抗也不算高，如果你只是前期加，100ng/ml 应该问题不大，我做的培养体系也是这个浓度，基本上没有什么问题

作者: 刘艳85 时间: 2013-7-6 11:44

请问你用的是什么培养基？这个不是细菌污染，是不是细胞密度过高得不到营养而死亡导致的问题呢？

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-6 12:47

回复 sunny.yc 的帖子

另外一个就是IFN-r，这个应该如何加呢？是在加抗CD3抗体前24小时加，还是制备当天与抗CD3抗体一同加入呢？加入的浓度应该多少呢？2000U/ml算高还是低呢？

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-6 12:53

回复刘艳85 的帖子2 w/ x. g' U+ h

用的是AIM-V ，如果是细胞密度过高的话，你认为培养袋中的细胞密度应该为多少比较合适呢？现在就是一直在找集落聚团的原因，你们以前遇到过这种情况吗？是如何解决的呢？

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-9 13:08

回复 lyj-0017 的帖子8 U, }/ v! X1 I% d( x

你的量是从哪看到的，都太高了吧，试试1000单位的干扰素γ，D0天一般只加干扰素

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-9 13:08

回复 lyj-0017 的帖子. n. V2 e0 Z7 g8 K0 d2 {

你的量是从哪看到的，都太高了吧，试试1000单位的干扰素γ，D0天一般只加干扰素

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-9 20:05

回复 sunny.yc 的帖子
0 y& ~' c u: R) p e; Z: _- a
记错了，IFN-r应该是1000U/ml。现在纠结的问题就是到底可不可以D0天三种细胞因子同时加？与传统工艺效果哪个更好一些。。。

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-10 14:36

回复 lyj-0017 的帖子8 F! u$ p- {& M! r* k
: e( l& C# l, b' L7 R Z5 C
建议还是分开加，挺多文献都有这样的描述，而且理论看起来都很合理的
/ w* k" m, c! u: o/ v& |
如果你还是在纠结的话，建议你连续做几个平行实验看看，可能对于你的培养体系来说，D0加一种或加三种影响不大呢

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-10 22:40

回复 sunny.yc 的帖子

最近看文献看到有这么做的，D0天添加IFN-r和anti-CD3 mAb,第二天添加IL-2，后续培养以IFN-r和IL-2维持，按文献所说扩增倍数还挺高的~

作者: sunny.yc 时间: 2013-7-11 10:40

回复 lyj-0017 的帖子, `. C3 i! X$ ]! A

可能我了解得还太少，持续加干扰素还是第一次听到，试试看吧！

作者: jenvy121 时间: 2013-7-24 13:13

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0 G) |: z+ S2 i2 n+ v
不知你们的培养体系有多大？一般用多少预热多少，而且预热的时间也不长，不会出现很大的酸碱失衡吧

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-24 13:48

回复 jenvy121 的帖子
* B- B2 p6 b: p S/ g, {4 m u. r4 e
培养体系得看分离得到的单个核细胞数量，根据5~10X10^5/ml的细胞密度铺袋。你后面说的预热多少没看懂，应该是问预热多少培养基吧？一般预热一瓶培养基，培养基手感不那么凉即可添加。酸碱失衡我觉得不可避免，但是不会出现太大失衡~

作者: jenvy121 时间: 2013-7-24 13:55

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对的，我们每次换液计算好用的培养基的量，然后预热

作者: lyj-0017 时间: 2013-7-24 20:03

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你们用的是机采吗？还是直接采外周血？现在培养一次最多能获得多少细胞呢？

作者: jenvy121 时间: 2013-7-25 09:27

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直接采外周血，数量也是因人而异吧

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