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标题: 关于质粒抽提的问题 [打印本页]

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-7-14 21:57 标题: 关于质粒抽提的问题

我最近抽提质粒用来做酶切鉴定，可是做了好几次，每次在抽提步骤中的蛋白沉淀，离心沉淀老是停留在中间，导致上清只有一小部分，在下面有一部分，导致不好吸下面的，使得抽提的质粒浓度低，而且不纯，刚开始以为菌液浓度太大了，于是摇了一次少的，可是还是会出现之前的情况，请问谁有遇到过，或者能够解决，感谢回答。

作者: 250286645 时间: 2013-7-15 09:49

那会不会是你离心速度不够呢我们都用12000G

作者: xld1984 时间: 2013-7-15 12:34

自己做不好，买试剂盒，挺好的" W0 Z/ k+ l. f& W! _+ ^

作者: 小咪咪 时间: 2013-7-15 14:17

有可能离心速度和时间不够，我做这个实验的时候一般都可以把它离下去的。但有次量不小心加大了，分了两次离也出现过这种情况，那时我就改用了中枪头吸，效果也比较好，吸到的白色沉淀也比较少。再不然你就不要最后的留在管底的一点点液体了，因小失大不值啊~不要可能质粒浓度会高一点~

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-7-15 22:06

回复 250286645 的帖子" e& k. A4 p7 L) c. i+ Z1 I* S
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恩，应该不是我也是用的12000g，而且离心时间加长了，还是不行，这个情况应该排除了呢

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-7-15 22:07

回复 xld1984 的帖子

就是用的试剂盒，用的是transgene的中提试剂盒

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-7-15 22:10

回复小咪咪的帖子0 M* p% {$ C' q$ K. c/ ?
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灰常感谢，用中枪头的建议不错，下次我试试，不过下面的不要的话，上面的太少，感觉质粒浓度仍然高不了。但是我同时做的实验，帮别人提质粒就能够离下去，好奇怪。

作者: Dancmacabre 时间: 2013-7-23 23:09

鉴于这种情况，首先不会是试剂问题，可以肯定的是实验操作不熟练，没有注意细节。加溶液2时，一定要保证菌液充分裂解，但千万不要去剧烈颠倒摇晃，防止提出基因组。其次容易忽略的是，加溶液1后菌液重悬不充分，这一点也很重要。加溶液3后，你放心大胆的去摇它，不会有事儿。加溶液3之后，在-20度冰箱放10min最后12000转离心15min。你试试看，行不行。

作者: chenhuachen 时间: 2013-12-6 17:55

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！$ A$ Z P6 E1 S2 _0 f9 L) H3 ^
人的或者大鼠的野生型p53都可以。

作者: 我爱火热的冬天 时间: 2013-12-8 12:15

回复 Dancmacabre 的帖子) o; D' @, S5 Q a" {

已经解决，感谢各位帮忙解答，应该是我用的菌液太多了，蛋白沉淀太多造成的，后来用5ml菌液成功搞定

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