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标题: 分子生物学硕士新手载体构建心得 [打印本页]

作者: Damon-Salvatore 时间: 2013-7-17 21:04 标题: 分子生物学硕士新手载体构建心得

                                                                                                                                                   分子生物学硕士新手载体构建心得（转自生物帮）
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      构建载体花了我 3 个月的时间，真是折磨人，幸好我的心态好。如果你要问为什么构建个载体会花这么长的时间，确实，对于一个熟悉分子生物学技术的人来说，应该 2-3 周就差不多了。花这么长时间，首先因为我在试验方面完全是个新手，以前搞临床几年了，现在读专业型的硕士学位，在学校读分子生物学时就是朦朦胧胧的，基础比较差。其次在做实验时没有特别懂得、专门的人来带我，所以在做的过程中充满了艰辛。现在终于构建成功了，总算舒了一口气，不过后面的路还长，据说更难，走一步算一步吧。把我构建载体的过程及出现的问题写出来，希望能给像我这样的战友一些启示，祝大家早日把试验做成功。
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一、PCR 过程中的经验教训
   做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟 genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶
的退火温度是 Tm 值+3 度。PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。我就曾经用普通的酶进行过 PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。
二、PCR 产物直接酶切后连接不成功 $ P7 l; _  v% a, y, h
   当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。因为这个时候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧." p% J2 y/ X& j5 e8 w; O0 B% ?) [
三、T-A 克隆应注意的问题 / x$ F4 U6 p/ K, w
   T-A  克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题要注意的。T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。但要注意，首先是 T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的 T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。进行加 A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。我开始就是这样，想着节约，说明书写的是 PCR 产物加 15ul,我没舍得，加了 3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。后来我 PCR 产物加为 6ul,就成功了，屡试不爽。最后，在连接产物加入感受态细胞后，轻弹混匀，稍微离心一下，不要剧烈的震荡，反正我失败的时候都是力度较大，也不知道有没有关系。0 W. ^, z) V8 z( H. U
四、菌液 PCR , ~2 ?. m1 y2 v
   T-A 克隆成功后，你可以看到很多蓝白斑，一般来说蓝斑要比白斑稍多。不是每个白斑都是你要的东西，下面就是阳性克隆的筛选了。挑白斑到摇菌管过夜摇菌，然后进行菌液 PCR。关于菌液 PCR 引物的问题，有的人用克隆引物，有的人用专门设计的检测引物，两者我都用过，只要检测引物能 P出来，完全符合，所以一般的时候用克隆引物就可以了，除非起始点就出现错配的情况。
五、碱法小提质粒
   挑取阳性克隆的菌液，抽提质粒吧。既然是小提，就不要很多菌液，一管就够了，3-5 毫升，开始以为菌液越多越好，其实是错的，首先这点菌液提的质粒够你测序及酶切用了，其次加多了反而不好，因为加的裂解液是相对固定的，多了可能裂解不完全啊。提取质粒有传统的自己配制的酚氯仿抽提，也可以购买试剂盒。我还是倾向于用试剂盒，尤其是像我们这些并不打算在实验方面有所专长的初学者。国产的试剂盒很便宜，如天根的质粒小提试剂盒，一次大约也就 4 块钱，足够用的了。而用酚氯仿抽提吧，很容易出现质粒不纯的情况，在测序时无法测出信号。当然，这也可能跟个人有关，师姐们都建议后者，在他们看来，简单实用，价格更便宜。如何选择，就看自己的了。
六、酶切胶回收 % C/ o5 }# M! k" Y3 e  m, W2 z* c8 F
   测序结果正确的话那就恭喜你了，至少你已经拿到了目的片段，下面就酶切胶回收吧。将目的片段及载体进行酶切，并行酶失活，然后电泳胶回收。我回收过几次，但回收效率不高，也不知是什么原因。跑胶时条带很亮，酶切也很充分，但一回收就没了，尤其是目的片段常常都看不到。很郁闷，这时候我多做了两个酶切回收体系，同时进行胶回收，加大量回收后跑电泳总算能看到目的片段了，虽说不亮，但总算有。个人认为，将 50ul 的酶切体系不要放在一个孔里面跑胶而是分成两到三个孔跑胶然后回收可能会增加回收的效率。 $ R  {" _$ b6 M( n# z4 R* K' @& p
七、酶切产物连接   z8 @0 y8 V2 h7 {% E' n
   载体与目的片段的摩尔比常常为  1：3-10，但酶切回收后的产物测浓度常常测不出来。怎么去按这个比例进行连接反应呢。回收后将目的片段和载体同时跑胶比较亮度，根据亮度的比较再结合分子量来确定两者的体积比。如亮度比为 5：1，两者的分子量比 10：1，体积比大约为 1：3.  不要担心产物的浓度低会影响连接，其实连接只要那么一点点就够了。我的阳性对照加的质粒只有0.1ng，结果菌落长得满满的。
八、挑取阳性克隆测序1 y( A) @' @3 i' x
   转化成功后挑取阳性克隆的菌液进行质粒小提，同时保存菌种，送测序。如果测序成功，就表示你的载体构建正式成功了，恭喜你啊，休息几天吧！

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作者: nauticus 时间: 2015-5-29 07:54

谢谢哦

作者: 剑啸寒 时间: 2015-6-22 21:27

看完了这么强的文章，我想说点什么，但是又不知道说什么好，想来想去只想

作者: beautylive 时间: 2015-7-15 08:43

这个贴好像之前没见过

作者: s06806 时间: 2015-8-5 14:52

@,@..是什么意思呀？

作者: yukun 时间: 2015-8-12 22:18

一定要回贴，因为我是文明人哦

作者: 依旧随遇而安 时间: 2015-8-15 12:43

免疫细胞疗法治疗肿瘤有效

作者: 科研人 时间: 2015-8-20 15:01

我想要`~

作者: 我心飞翔 时间: 2015-8-25 20:01

围观来了哦

作者: 杏花 时间: 2015-8-27 12:26

是楼主原创吗

作者: 龙水生 时间: 2015-9-12 07:42

我该不会是最后一个顶的吧

作者: 泡泡鱼 时间: 2015-9-12 23:04

脂肪干细胞

作者: 榴榴莲 时间: 2015-10-4 14:10

慢慢来，呵呵

作者: 舒思 时间: 2015-11-1 00:51

支持你一下下。。

作者: foxok 时间: 2015-11-21 12:40

哦...............

作者: xuguofeng 时间: 2015-12-25 11:10

帮你项项吧

作者: 陈晴 时间: 2015-12-25 18:18

好贴坏贴，一眼就看出去

作者: 石头111 时间: 2016-1-25 17:32

我的啦嘿嘿

作者: 命运的宠儿 时间: 2016-1-26 21:42

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!

作者: biobio 时间: 2016-2-2 20:43

不知道说些什么

作者: 依旧随遇而安 时间: 2016-2-5 19:24

回复一下

作者: 生物小菜鸟 时间: 2016-2-26 12:00

你还想说什么啊....

作者: 小敏 时间: 2016-2-28 13:18

干细胞与动物克隆

作者: 橙味绿茶 时间: 2016-3-15 11:09

这个贴不错！！！！！

作者: nauticus 时间: 2016-3-16 08:18

天啊. 很好的资源

作者: 昕昕 时间: 2016-3-21 22:18

干细胞研究非常有前途

作者: 365wy 时间: 2016-3-27 19:01

呵呵高高实在是高~~~~~

作者: 求索迷茫 时间: 2016-4-7 10:27

ding 支持

作者: tuanzi 时间: 2016-5-8 21:18

嘿嘿......哈哈......呵呵.....哟~呼

作者: 知足常乐 时间: 2016-5-10 11:18

干细胞与基因技术

作者: 快乐小郎 时间: 2016-5-12 09:01

干细胞研究还要面向临床

作者: 知足常乐 时间: 2016-5-12 10:18

希望可以用些时间了~````

作者: 蝶澈 时间: 2016-5-16 22:01

给我一个女人，我可以创造一个民族；给我一瓶酒，我可以带领他们征服全世界。。。。。。。。。

作者: netlover 时间: 2016-6-5 21:01

支持~~

作者: 我学故我思 时间: 2016-6-8 22:26

我想要`~

作者: ines 时间: 2016-6-18 21:07

我是来收集资料滴...

作者: 安生 时间: 2016-6-24 13:26

回帖是种美德.

作者: tian2006 时间: 2016-6-27 08:11

我来看看！谢谢

作者: 求索迷茫 时间: 2016-7-6 18:09

转基因动物

作者: bioprotein 时间: 2016-7-21 17:35

有才的不在少数啊

作者: biobio 时间: 2016-7-23 11:54

不错不错.,..我喜欢

作者: 橙味绿茶 时间: 2016-8-27 12:54

细胞治疗行业

作者: aliyun 时间: 2016-9-21 22:25

继续查找干细胞研究资料

作者: haha3245 时间: 2016-10-31 21:53

干细胞治疗糖尿病

作者: 某某人 时间: 2016-11-14 18:18

希望大家都有好运

作者: Greatjob 时间: 2016-11-17 15:26

我等你哟!

作者: 干细胞2014 时间: 2016-11-18 14:26

加油啊！！！！顶哦!!!!!

作者: vsill 时间: 2016-12-4 04:17

不管你信不信，反正我信

作者: 20130827 时间: 2016-12-12 08:43

支持一下吧

作者: 命运的宠儿 时间: 2016-12-28 08:35

@,@..是什么意思呀？

作者: awen 时间: 2016-12-30 00:07

转基因动物

作者: 碧湖冷月 时间: 2017-1-17 17:42

干细胞库

作者: s06806 时间: 2017-1-26 02:12

干细胞行业门户干细胞之家

作者: 大小年 时间: 2017-2-8 02:11

楼上的话等于没说~~~

作者: pcr 时间: 2017-2-19 09:27

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: SCISCI 时间: 2017-2-20 00:20

不错，感谢楼主

作者: sky蓝 时间: 2017-3-6 22:18

是楼主原创吗

作者: xuguofeng 时间: 2017-3-22 12:01

我的啦嘿嘿

作者: 追风 时间: 2017-3-23 20:55

嘿嘿......哈哈......呵呵.....哟~呼

作者: alwaysniu 时间: 2017-3-29 02:27

干细胞之家是不错的网站

作者: 生物小菜鸟 时间: 2017-4-4 03:52

干细胞行业

作者: wq90 时间: 2017-4-21 03:00

好啊，谢楼主

作者: dogcat 时间: 2017-5-17 15:10

努力,努力,再努力!!!!!!!!!!!

作者: 红旗 时间: 2017-5-19 13:01

好帖，有才

作者: 剑啸寒 时间: 2017-6-14 17:07

支持一下吧

作者: ines 时间: 2017-7-14 15:10

不要等到人人都说你丑时才发现自己真的丑。

作者: Kuo 时间: 2017-7-26 18:33

哈哈,顶你了哦.

作者: 20130827 时间: 2017-7-28 21:27

支持你加分

作者: 再来一天 时间: 2017-8-23 06:05

干细胞之家我永远支持

作者: 旅美学者 时间: 2017-8-24 17:22

呵呵哪天得看看 `~~~~

作者: 科研人 时间: 2017-8-30 02:30

病毒转染干细胞

作者: 舒思 时间: 2017-9-6 20:42

我在顶贴~！~

作者: 罗马星空 时间: 2017-9-24 07:07

好人一生平安

作者: 墨玉 时间: 2017-11-15 17:58

我的啦嘿嘿

作者: Whole 时间: 2017-12-11 08:17

这个贴不错！！！！！看了之后就要回复贴子，呵呵

作者: xiaomage 时间: 2017-12-18 15:43

挺好啊

作者: 草长莺飞 时间: 2017-12-27 14:10

加油啊！偶一定会追随你左右，偶坚定此贴必然会起到抛砖引玉的作用~

作者: dada 时间: 2017-12-31 04:35

今天没事来逛逛

作者: 黄山 时间: 2018-1-6 15:52

发贴看看自己积分

作者: dglove 时间: 2018-1-11 20:43

小生对楼主之仰慕如滔滔江水连绵不绝,海枯石烂,天崩地裂,永不变心.

作者: xiaomage 时间: 2018-2-3 23:38

不早了各位晚安~~~~

作者: 安生 时间: 2018-2-12 11:28

拿分走人呵呵，楼下继续！

作者: tempo 时间: 2018-2-15 07:35

干细胞研究非常有前途

作者: dongmei 时间: 2018-2-19 19:09

小心大家盯上你哦

作者: yukun 时间: 2018-2-24 14:01

支持~~顶顶~~~

作者: 我心飞翔 时间: 2018-2-28 14:54

免疫细胞疗法治疗肿瘤有效

作者: 依旧随遇而安 时间: 2018-4-11 04:57

好好帖很好帖确实好帖少见的好帖

作者: 小敏 时间: 2018-4-13 00:43

一楼的位置好啊..

作者: doc2005 时间: 2018-4-15 15:17

dc-cik nk

作者: xuguofeng 时间: 2018-4-18 01:36

很有吸引力

作者: vsill 时间: 2018-4-25 21:49

慢慢来，呵呵

作者: doors 时间: 2018-5-24 05:09

感觉好像在哪里看过了，汗~

作者: 求索迷茫 时间: 2018-6-11 22:19

不错!

作者: 三星 时间: 2018-6-16 07:27

我想要`~

作者: Diary 时间: 2018-6-17 05:10

免疫细胞治疗

作者: biodj 时间: 2018-7-3 09:43

我在努力中

作者: 小丑的哭泣 时间: 2018-8-16 22:54

谢谢分享了!

作者: tuting 时间: 2018-8-29 23:35

脂肪干细胞

作者: ladybird 时间: 2018-10-4 15:54

干细胞治疗糖尿病

作者: 加菲猫 时间: 2018-10-8 03:25

哈哈,这么多的人都回了,我敢不回吗?赶快回一个,很好的,我喜欢

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