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标题: 如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH??? [打印本页]

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-30 09:50 标题: 如何验证蛋白是否进入细胞核，用immunocytochemistry，DAPI,ISH???

有哪些指标，可以验证构建的蛋白是否入核？？？希望各位战友给出宝贵意见和建议

自己的思路：用DAPI对核进行定位，用免疫荧光染色对蛋白进行定位；将两者在荧光显微镜下的图片重合，看蛋白是否进入核内& R' c' b& M; y# d# P
7 P" |/ i) Z! e, S
问题：细胞是立体的结构，细胞核的上下前后及细胞核里面都可能有构建的蛋白，  前后的蛋白和细胞核里面的蛋白可能造成混淆，导致不能很好的确定蛋白是否进入核内。

拟解决方法：  - y: V/ [' Y' g; p4 v* I
方案1  ：用激光共聚胶显微镜拍摄立体图片，能否排除上述问题？自己没用激光共聚胶显微镜拍摄过，不知道可不可以避免这个问题（自己这边有这个条件）。
方案2 ：试着找一种只在细胞质特异表达的蛋白，对其进行免疫荧光染色；如果其不影响 DAPI对细胞核的定位，则可以推测出细胞核的位置，再与构建的蛋白比较，看是否入核（ 6 Z7 H0 d1 [( E1 k% X" B
            写着发现有点牵强···）
方案3：老板说试着用原味杂交的方法去验证下，当时自己不是很懂，就说回来查资料。  现在基本上也是一头雾水···

  W: E' B  l( Y6 G0 N

恳请各位战友给出宝贵意见和建议，进来了就留下点东西哦···

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-30 09:51

自己顶一个···

作者: 小兔子lp 时间: 2013-7-30 10:32

个人感觉原位杂交法靠谱些，另有荧光原位杂交法更加直观~原位杂交是利用探针技术，精准性更强。

作者: daiying5200000 时间: 2013-7-30 12:40

建议用荧光共振能量转移。

作者: 寒山拾得 时间: 2013-7-30 13:19

IF & 提核蛋白WB

作者: 妖妖空 时间: 2013-7-30 20:12

1、虽然没有做过这方面的工作，但是一般要进入细胞核的蛋白质都是具有NLS序列的，你可以看下自己的蛋白质是否存在这段序列；
2、免疫荧光一般是不会用于蛋白质在细胞中的定位，而他们提到的 in situ hybridization主要是用于细胞内特异的DNA或者RNA的定性；& x3 K5 o# W4 V" K
3、如果知道与其相互作用的细胞核内的可做内参的蛋白的话，FRET是一种很靠谱的方法，他可以避免关于切片引起的空间问题；8 c' G& z9 w/ X9 l$ A( p
4、如果实验室有条件的话，我觉得放射自显影可以尝试一下，毕竟电镜的放射自显影效果还是很好的；- T# {) ^% k9 K6 w
5、如果继续尝试你们的思路的话，我觉得分别对细胞骨架蛋白染色的效果更明显一些，可以把中间丝染色，然后可以看到很明显的核纤层，这是能够看到的比较清晰的细胞核的轮廓，这样是要比DAPI效果好点的，当然这时候是要用confocal的。% d1 F1 k! k* A& u- K
6、把你们构建的蛋白构建成GFP融合蛋白，微管和原纤维状蛋白用其他可分别的非绿色染料标记（如罗丹明B等），细胞进行有丝分裂时候，你会看到一个很明显也很漂亮的图。4 E# ^3 s) h/ ~2 V7 ?7 j Z7 m
7、除了这些定位外，还需要很多与蛋白质本身性质及生理相关的实验来进行证明的，所以你的问题是不存在的，不可能通过这一个步骤就证明你的蛋白在核中定位的，这是做实验的常识，一个生物学问题需要很多直接的和间接的证据来证明的。
# [! ~( R, U/ C" n$ f
（PS：个人觉得，你还是搞清楚你构建蛋白的性质对于这个问题的解决才是最关键的，蛋白质通过核孔复合物进入细胞核内是一个很复杂的过程，大致上可以分为被动扩散和主动运输两大类，由于核孔复合体是一个亲水通道，有效直径是9~10nm，对于球形蛋白而言，基本上分子量在40000~60000的蛋白质都能自由通过；主动运输需要信号识别与载体的介导，还是一个需要ATP的过程，如果你的蛋白质可能是主动运输的话，根据主动运输的机制就可以设计其他的动态鉴定方法了。）* U: B' m: d m8 Y/ Q& D2 E

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-30 21:08

回复妖妖空的帖子$ s+ p* H2 C; D- U/ _8 ]

首先谢谢你们的意见和建议；9 k2 d: e  G7 j/ i7 O8 j. r' \

自己做的是用蛋白诱导iPSCs；
构建的蛋白上右一个9R（九聚精氨酸，一种细胞穿膜肽）结构，起到透过细胞膜的功能，同时含有一个His-tag 标签，后期可以对这个标签染色，对蛋白进行细胞内部的染色。/ ^9 @$ X. X3 L' }( U( i2 h
蛋白是用原核表达系统表达出来的，是不是球形自己也不清楚；碱基数在1000-1500之间；大小在30-60kda（应该是你说的 30，000-60，000）之间，用western blot都检查出了。但是我的试验目的就是让蛋白尽量的进入核内，所以我看的很多文献（用卵母细胞提取物诱导iPSCs）都使用了ATP 再生系统，但它们对细胞是否进入核内说的比较模糊；

还希望妖妖空能给点建议，  自己刚开始独立做实验，很多东西还不会，还望多多指教！; Z/ S7 t- T5 }4 Z, W4 @6 `$ @9 _
对验证指标还是不太清楚，可能首先尝试下 DAPI 染色吧  8 y; u8 E6 z; X7 X

各位可有原位杂交的protocol？？？

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-30 21:10

本帖最后由细胞海洋于 2013-7-31 09:39 编辑

回复小兔子lp 的帖子9 c( ]5 P+ K9 M. I- ?4 \8 c* O
6 Z6 ?* L0 u9 ]# I$ P/ B, H) y
可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-30 21:14

回复寒山拾得的帖子

问题: 1. 提核蛋白应该用试剂盒，其提取的精确度怎么样。
) N7 ?% z9 H: A9 k& r
因为细胞质的目的蛋白还是很多的，是否会影响到提取的结果？？？

如果可以的化，那个牌子的试剂比较好！！！

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-30 21:15

回复 daiying5200000 的帖子3 G% b" R) X! a

一个完全陌生的专业词汇···

作者: daiying5200000 时间: 2013-7-31 09:00

关于楼主所做的实验：重组蛋白诱导IPSC。最重要的一点，蛋白必须进入细胞核，蛋白必须与目的DNA结合，促进OCT4，SOX2等的高表达。这个就是原理。
那么仅仅是蛋白质通过穿膜肽进入细胞核是不够的，是没有说服力的，因为你的蛋白可能没有作用，可能会降解。所以用荧光能量共转移可以显示这点。就是一个荧光素比较你的DNA序列，另外一个标记你的目的蛋白，如果他们紧密结合将产生共转移，可以通过仪器显示出来。
至于普通的荧光染色，用DAPI等染色，甚至是共聚焦，效果不是很好的，没够足够的说服力，不过用细胞骨架定位或许可以。之前有好几篇文章都提到这点，有两篇文章甚至是一个失败的例子来说明这些问题，只是现在我这些文章找不到了。) N# K i/ B/ |0 d) r% G! ~. v
另外，有如下方法可用：1 S1 F) l7 }3 P: i! C. f3 c
用量子点的标记方法，通过去卷积显微镜观察也是可以看到的，只是比较麻烦。
用纳米包被蛋白与荧光素也是可以的，当然必须有成熟的纳米技术和你合作，这个很好发文章。 _$ W" R7 ^1 M* ]3 N! g: }! L
我们曾经和光电物理学院合作，构建过细胞的三维图像，在他们那里高倍数的显微镜下可以检测到细胞内部分子成分的变化和位置，但是对实验的场地要求很严格，光电学院是没有培养室的，呵呵。
还有一点，你的蛋白构建的穿膜肽是加在蛋白的C端和N端情况不一样的，而且各种蛋白都不一样，所以你诱导成功的几率也不是很大，看你运气了。这点在KIM的一篇CELL上有提到过，他也举出了他们失败的例子，就是C端和N端的问题。
我们实验室以上方法都有尝试，共转移的方法用的多，效果不错。去卷积也用过，效果一般般，但是图片漂亮，放到文章里面感觉饱满，呵呵。
祝你好运！

作者: 小兔子lp 时间: 2013-7-31 09:38

回复 Andyhigh 的帖子- h$ [1 n" B5 O; s2 h! Z2 o

我手边没有现成的protocol，但很多文章中都用了这个方法，你可以查一下~

作者: 小兔子lp 时间: 2013-7-31 09:42

Andyhigh 发表于 2013-7-30 21:10 2 t3 g- o- a$ }1 y5 c
回复小兔子lp 的帖子' t2 b/ F; w9 i% ^; M8 D# V0 I

/ @& N/ I- o" C; s$ I! Z% ]可有原位杂交的 protocol，能发份给我嘛，

手边没有现成的protocol, 但很多文章中都用了这个方法，可以查一下~

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-31 15:51

回复 daiying5200000 的帖子+ _+ n' `$ \$ f2 P

很想找到 “ 至于普通的荧光染色，用DAPI等染色，甚至是共聚焦，效果不是很好的，没够足够的说服力，不过用细胞骨架定位或许可以。之前有好几篇文章都提到这点，有两篇文章甚至是一个失败的例子来说明这些问题” 和 "这点在KIM的一篇CELL上有提到过，他也举出了他们失败的例子，就是C端和N端的问题'' 这几篇文章，尝试了下没有找到

作者: daiying5200000 时间: 2013-7-31 16:36

回复 Andyhigh 的帖子

很可惜，我也找不到了。找了几篇其中有失败的总结。以及蛋白质在细胞内的检测。

附件: 09-Kim蛋白质产生ips!-Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direc.pdf (2013-7-31 16:33, 1.01 MB) / 下载次数 2
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTQwNzR8MzY1ZGI3MzB8MTc5Mzk1MTI2MHww

附件: supplement-01.pdf (2013-7-31 16:34, 995.27 KB) / 下载次数 2
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTQwNzV8MDU2MTk4Y2Z8MTc5Mzk1MTI2MHww

附件: 2010-中国的蛋白诱导Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant p.pdf (2013-7-31 16:34, 620.84 KB) / 下载次数 2
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTQwNzZ8ZDVhNDI5OTl8MTc5Mzk1MTI2MHww

附件: 09-蛋白诱导Cell-Free Production of Transducible Transcription Factors for Nuclea.pdf (2013-7-31 16:35, 304.82 KB) / 下载次数 3
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTQwNzd8MTQ5NjkxNjV8MTc5Mzk1MTI2MHww

作者: Andyhigh 时间: 2013-7-31 16:40

回复 daiying5200000 的帖子
7 T3 x0 m# O# h' U" u! f; Z
真的很感谢，虽说第一篇已经有了，干细胞之家真是个好论坛！！！

作者: 妖妖空 时间: 2013-8-1 05:13

回复 Andyhigh 的帖子
9 U y/ y Z( S/ o0 p5 V
那个就是我说的FRET方法，方法很成熟，你可以到springer找下它的protocol。

作者: Andyhigh 时间: 2013-8-1 16:34

回复妖妖空的帖子9 [' U$ S9 [: V" }6 K+ y

按照你的方法，我也找到了FRET的相关资料；不过我还有个疑问，就是FRET技术需要哪些仪器和试剂？？？我们实验室有倒置的荧光显微镜（奥林巴斯的），学校有激光共聚胶显微镜。所需试剂及牌子我也不是很清楚，希望妖妖空能为我解答下，谢了啊！！！

作者: Andyhigh 时间: 2013-8-1 16:39

回复 daiying5200000 的帖子

你给我的这几篇文章，帮助挺大的；自己在这基础上，又找到了一篇Cooke组的另一篇文章《Activation of Innate Immunity Is Required for Efficient Nuclear Reprogramming》--2012年

不过我还有个疑问，就是FRET技术需要哪些仪器和试剂？？？我们实验室有倒置的荧光显微镜（奥林巴斯的），学校有激光共聚胶显微镜。所需试剂及牌子我也不是很清楚，希望宁能为我解答下，谢了！！！

作者: daiying5200000 时间: 2013-8-1 16:48

本帖最后由 daiying5200000 于 2013-8-1 16:53 编辑

回复 Andyhigh 的帖子, d) H' n* X3 u1 K9 m, a

我今年已经毕业了，具体的记录都没带出学校。是有个试剂盒与特定的仪器，一般都会有方法说明的。由于我们实验室以前经常做基因工程药物，要测定蛋白是否进入细胞而且定位在哪里，有没有作用所以才有这个技术。我们都是实验员做的。所以我也记不清了，不好意思。如果共聚焦可以的话，是比较快捷的方法，共聚焦也是可以构建三维的，技术员一般都会的，只要你双染就可以分辨。我师弟师妹做过共聚焦的，细胞染色三维立体图，还不错。

作者: luyue6453 时间: 2013-8-1 17:03

回复 Andyhigh 的帖子5 G1 I4 y* C @) M o" \4 o/ T
& P# `5 r {4 O3 ^! @
我做过原位荧光杂交，说起来也比较容易，当时失败率还是很高的，你首先将细胞收集起来做核型分析，最好细胞处在分裂中期，这样染色体很好看，然后将这些片子放在四度冰箱放染色体降解，之后你用罗氏的试剂盒做探针，按照试剂盒做就可以了，然后再与片子杂交，这个过程中注意事项很多，你研究研究，最后DAPI染色就可以观察了，一下子就能定位到时候在染色体上。你要是觉得麻烦，你最好外包吧，有很多公司帮忙做这个！

作者: Andyhigh 时间: 2013-8-1 17:29

好的，谢谢啊！很需要这方面的信息

最近有些人也在推荐我外包一些试验，看到我

了3 ^5 y* _& G1 f( _) r: }6 z$ s9 h
* R+ ] @" H# u0 p$ H" v
可能后面还要请教你呢，谢了！！！

作者: Andyhigh 时间: 2013-8-1 17:37

回复 daiying5200000 的帖子
3 \# I+ A6 N/ n# E
好的，谢谢啊！到时候估计还要请教你···

作者: 妖妖空 时间: 2013-8-1 18:42

回复 Andyhigh 的帖子

这个我也不是很清楚的，都是实验室的技术员在做这些东西，我们只看最后的结果，自己的最后观察时用的是430nm激光激发GFP，受体的YFP接受CFP激发转移的能量，能看到530nm的荧光。

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