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标题: CIK细胞的制备方法 [打印本页]

作者: defu 时间: 2013-8-1 01:59 标题: CIK细胞的制备方法

【背景】$ m: n- `& l! {3 p" K
      CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-g,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。% ^- g# |: U1 z
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【培养原理】8 \+ ~& M8 ^" O+ p
CIK培养用细胞因子和抗体：
& t+ `7 y% B4 `, d. A
•CD3激发型单抗：
      T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的7 I% A; B) D  J1 K% C
  抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与
  CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD49 b  G7 I) ]3 P/ K4 y, t
  或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆的
  免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的& o3 ]( r9 o# w# Y0 g
  酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，: ?0 u9 a/ l$ v
  最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-g等)，引起基因的
  表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。

      由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特: W3 I+ ^4 ^) s. I" e
异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，
从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引
起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。* b5 V5 n% g) n; m
  5 ]3 d* t1 ]( x' d
      此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激7 M2 U4 L+ R  P
所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最
好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
•IL-2 (白细胞介素-2)% d9 u6 X" @6 V0 T
      IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2
既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活" C& k9 F, R! P. z' A
化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，2 ~2 R( m1 l/ W/ p# `9 Y, v  Z
以促进T细胞的增殖与活化。
•IFN-g(干扰素-g)
      IFN-g具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在% c* q+ p* J  k5 G) }" D0 R' c7 S$ s
  诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-g ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-g加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相5 ]. R/ q. x5 b6 F0 Q2 {
  关。先加入IFN-g，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。  i( \* F, l& Y& L7 G& H
• IL-1-a (白细胞介素-1a) 　
      IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-g和激发型CD3单抗合用时，可以明显提
  高CIK 的细胞毒作用。% A' d1 M6 T4 N' W

【细胞制备】0 e. d( ]' e8 G/ v5 r  i$ h
1.  外周血单个核细胞的采集% c4 W( t" O" ]- K+ Z
   1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
   1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
   1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。
  2.  CIK细胞的培养及鉴定6 y! a; S! Z1 w: [
   2.1 将PBMC按1-2 x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1000 U/ml 的重组人IFN-g，37oC，5%CO2培
            养箱中培养；' G- M0 q4 m5 U+ e+ Z
   2.2 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖。
            注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1a。
   2.3    每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
   2.4    在培养的第14d，收获CIK细胞。
   2.5    CIK细胞质控：
         2.5.1    台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；$ x% c3 A% \+ s
         2.5.2    流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
         2.5.3    细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效
                        应细胞与靶细胞按10 : 1(数目比) 的比例加入96 孔U 型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200
                        ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀; ~  J; t8 W" g/ ]: g0 w
                        伤率。
         2.5.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检
                        测阴性，内毒素<5 Eu)。

【步骤简图】- M% G' L- X/ C0 J, Z7 G
% U( Y( F3 s3 a: l
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作者: zhouyuchuan 时间: 2013-8-1 08:38

作者: Life_Tech 时间: 2013-8-1 09:47

支持分享。

作者: helong 时间: 2013-8-1 10:33

CIK本来是特指用上述流程制备的混合免疫细胞，但目前来看，可以适当调整方法（如增加细胞因子、共刺激抗体，甚至加入自体或异体DC等）来诱导，仍然属于CIK范畴。其实CIK顾名思义，应该用细胞因子诱导起来的有杀伤细胞的都算CIK，包括LAK、TIL、CAR-T等。这样该三类技术范围就扩展了。

作者: deshenglll 时间: 2013-8-1 10:44

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