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标题: 质粒线性化后，大家一般用什么办法回收？ [打印本页]

作者: 微笑流滢 时间: 2013-8-14 00:23 标题: 质粒线性化后，大家一般用什么办法回收？

质粒线性化后，大家一般用什么办法回收？1.是醇沉方法？还是试剂盒？一般用什么试剂盒呢？2.线性化的酶将质粒切开后是平末端，应该不会影响其整合到宿主染色体上吧？我想知道的是用于线性化的酶将质粒线性化后是平末端或者是粘性末端会对整合有影响吗？是不是平末端整合效率更高呢？还是？3.第一次自己做质粒转染，非常希望能得到自己想要的细胞系，所以希望大家能指点迷津，多帮帮我，感激不尽。多和我说些质粒转染需要注意的事项吧！

作者: app_1983 时间: 2013-8-14 08:54

质粒线性化后，可电泳检测是否线性化完全，紧接着做凝胶回收，使用凝胶回收的试剂盒，就可以；另外如果确定酶切后线性化完全的话，也可以直接用醇沉的方法纯化质粒；

作者: qkzhang 时间: 2013-8-14 08:57

1. 利用QIAquick gel extraction kit (QIAGENE)纯化处理回收。; W. [8 \& e& b8 Q
2. 粘性末端的直接用T4 ligase 连接即可，平末端的要phosphatasing处理防止自连
3. 根据你的质粒特点选择抗生素

作者: 微笑流滢 时间: 2013-8-14 09:51

回复 qkzhang 的帖子1 C9 B0 C0 B$ h3 n2 L5 e$ U2 A& E
1 { d0 A2 _6 X# }
您好，你说的第二条说如果是平末端还要为防止自连进行处理？？怎么处理呢》？我是要线性化后转染细胞，所以胶回收后是不是还得进行一定的杀菌处理？

作者: sylar.wy 时间: 2013-8-14 15:18

回复微笑流滢的帖子2 m/ O* c& N0 k' o: z

胶回收后直接可以转染了吧。漂洗液里有乙醇了。

作者: yahyo 时间: 2013-8-15 14:58

师妹，让师兄来告诉你！一、用PCR回收试剂盒直接回收（全式金）。二、可以用乙醇沉淀' K, C& Q! H% w+ L- a9 L
一般选择第一种！

作者: yahyo 时间: 2013-8-15 14:58

我是cZZ

作者: qkzhang 时间: 2013-8-16 10:23

回复微笑流滢的帖子

使用calf intestine alkaline phosphatase（CIAP）处理后可防止线性片段自连。

作者: chenhuachen 时间: 2013-12-6 17:55

小弟现在做p53对转化细胞代谢的影响，急求TET四环素诱导的wt-p53质粒，对接下来的实验非常重要，跪求论坛里的园友谁有这个质粒，可否赠小弟一点，不胜感激！8 I+ N. c; M) e) U
人的或者大鼠的野生型p53都可以。

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