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标题: 关于细胞质蛋白提取 [打印本页]

作者: 懵懂干细胞 时间: 2013-8-21 17:23 标题: 关于细胞质蛋白提取

本帖最后由懵懂干细胞于 2013-8-21 17:24 编辑 " S2 g# c1 [$ X

各位胞友好，请教个问题，我检测的细胞质蛋白表达量很低，所以我在考虑，提取蛋白时候细胞数量多一点，加少一点的碧云天的RIPA裂解液(强)，这样的话，上样时蛋白浓度就高点，就更容易检测出来，但是这样做的话，如果不把细胞先消化下来再裂解的话，操作性不强啊，比如小瓶细胞加200-250微升裂解液，这样肯定是覆盖不了整个瓶面吧，所以我想先消化下来，PBS洗几遍再裂解，对我要提取的细胞质蛋白没什么影响吧？操作性可取不可取啊？
谢谢解答

作者: app_1983 时间: 2013-8-22 08:42

先消化下来，在用PBS洗是可以的，但是要注意把PBS控干，然后再加蛋白裂解液，否则你还是不能保证得到高浓度的蛋白，另外还要注意整个操作要再4度条件下进行，防止蛋白降解，预祝你实验顺利！

作者: daviddow 时间: 2013-8-27 17:07

有些蛋白不行，消化后细胞的蛋白就没有了或者下降了。

作者: wateryong 时间: 2013-9-4 00:30

消化会对膜蛋白产生影响...如果不是膜蛋白应该就还好.0 q: l) R" _. S0 q9 k. ]
如果可以的话你用10cm的皿养细胞,然后用细胞刮将细胞刮下来(我们一般都用皿养,不知道用瓶子能不能直接用细胞刮刮下来,你可以试试),离心完后加少量ripa和蛋白酶抑制剂,再超声破碎4个循环,冰上裂解半小时,离心取上清液就行了.

作者: moonison 时间: 2013-10-3 00:40

这个没有问题，如果你怕消化有影响的话建议使用细胞刮刀，理论上不会伤害细胞的，直接把细胞刮下来，然后用PBS洗干净，离心之后再加合适体积的裂解液裂解就好了。

作者: innatestem 时间: 2013-10-3 08:23

1.看你用的是什么细胞，有些细胞很容易轻轻吹打下来，比如293T cells。有些细胞则需要消化下来。- I7 e3 c8 u4 b' k4 t
2.用PBS洗一次就可以啦
3.你用的裂解液建议最好在冰上预冷少许片刻。8 E4 a) ?' c8 M, a e
4.裂解液中要加蛋白酶抑制剂PMSF,NaF,Leu，Pepsin等，如果你涉及到磷酸化修饰相关的检测时，最好再加些NaF，NaVO3，Na2PO4等磷酸酶抑制剂。
5.再进行简单的超声破碎，离心，取上清。" m% C" D' {& T: D1 F
6.其实还有一种方法时获取细胞全蛋白的提取物，就是用2x sample buffer 直接加到你的细胞中，然后95度，5分钟。再进行简单的超声。如果你的蛋白很难检测到，上样跑胶时多上点样品。
7.祝好运

作者: zhu1019 时间: 2016-8-15 16:20

蛋白表达量低可以用大皿铺板，收细胞时不要用胰酶消化，直接将PBS加入皿内洗两遍，将PBS吸弃干净，加入适量裂解液，将皿底湿润，用细胞刮将细胞刮下，将细胞裂解液移入EP管。

作者: veda327 时间: 2016-8-18 11:13

你确定是只要细胞质蛋白还是可以总蛋白，这个对你所采用的方法是有很大的影响的！

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