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标题: 有哪位知道小鼠MSC向软骨诱导后，冰冻切片步骤？ [打印本页]

作者: 飘飞的心迹 时间: 2013-8-22 16:38 标题: 有哪位知道小鼠MSC向软骨诱导后，冰冻切片步骤？

细胞传到P3代后，开始向软骨诱导。由于是pellet培养，做冰冻切片的话是先用PFA固定，然后用梯度蔗糖溶液脱水吗？有谁做过，能详细指导一下吗，万分感谢。上次做过一次冰冻切片，但是没有找到pellet，是需要用染料标记一下位置吗？

作者: sun_happone 时间: 2013-8-22 17:06

先固定，然后用蔗糖梯度脱水，我一般用福尔马林固定，听说PFA对组织渗透性比较强，冰冻切片的切片厚度也很重要，可以向实验室的师兄师姐请教一下的。

作者: 飘飞的心迹 时间: 2013-8-23 14:46

回复 sun_happone 的帖子1 D3 g ?% @/ M7 k* |

很感谢！实验是现在做这个不是很成熟，是在摸索中。我们起步较晚，谢谢你的经验。我冰冻切片一般切10vm，或20vm，是不是有些厚了？

作者: myx142 时间: 2014-2-20 23:26

回复飘飞的心迹的帖子; I) A5 }" Q9 y4 D
' ]. K) r6 f* Z/ H
你好，请教一下你做pellet培养用的培养管是圆底的吗？什么材质的？在哪家公司买的？我怎么问的试剂公司没有卖的呢。。。

作者: 细胞海洋 时间: 2014-2-21 09:37

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作者: myx142 时间: 2014-3-25 22:31

回复飘飞的心迹的帖子8 N; e+ B! s0 r, ` |
3 H! u& @% I$ y
你好，请问你做冰冻切片的步骤是什么？我查到的如下：
1、4%多聚甲醛固定24小时。
2、20%蔗糖脱水至沉底。
3、沉底组织OCT包埋，-20度恒冷箱中切片。
请问哪里是欠缺？你们说的梯度浓度蔗糖脱水各个浓度分别多久？2 S/ H/ B0 ^; ~5 d, X8 W& B \
还有你是否试过石蜡包埋呢？这两种方法效果是否有差别？1 M) z$ k! L$ J+ N% O+ \
谢谢！

作者: myx142 时间: 2014-3-25 22:39

回复 sun_happone 的帖子& {$ ~8 j) y( n  f5 F) C
, U# I6 F& ]% b  e- ~1 N
你好，看到帖子你的留言。想请教你一些问题。希望能帮一下。非常感谢！2 p! `( {2 e+ c- R- e1 B! f: J
关于间充质干细胞软骨pellet诱导，诱导后的pellet怎么做切片。有说冰冻切片的，步骤入下：1、4%多聚甲醛固定24小时。- e% E4 m8 K1 D! B# [
2、20%蔗糖脱水至沉底。
3、沉底组织OCT包埋，-20度恒冷箱中切片。
请问哪里是欠缺？有说的梯度浓度蔗糖脱水各个浓度分别多久？
还有石蜡包埋切片步骤如下：0 l5 W' Q  l* M
1、福尔马林固定。
2、脱水：50% 乙醇（90min）→70% 乙醇（90min）→85%乙醇(90min) →95%乙醇(90min)→100%乙醇(60min)→100%乙醇(60min)。7 y  h+ p' U! A! p( H
3、透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯 → 二甲苯 → 二甲苯，每步60min。& F+ i# M) P) {- v; v/ X
4、渗透： 1/2二甲苯＋1/2石蜡(90min)→石蜡I (120min)→石蜡II(120min),62℃。; {  y9 ^' A8 z6 x3 w! r5 p
5、包埋：将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。- [- C4 p5 X$ f* d) f. q
6、切片、贴片。1 n' U- r2 O3 k7 `. z
请问这两种方法效果是否有差别？非常感谢！

作者: sun_happone 时间: 2014-3-27 20:01

回复 myx142 的帖子5 f) o4 P) g" b, `

好像石蜡切片的形态会保存好一点，切的片子更薄一点，但缺点是有抗原修复这一步，带荧光的抗体效果没有冰冻好，个人理解哈~~

作者: myx142 时间: 2014-3-27 22:57

回复 sun_happone 的帖子

非常感谢。石蜡包埋我说的步骤有哪些欠缺呢？请问你一般是怎么做的?

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