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标题: 悬浮细胞球的免疫染色方法 [打印本页]

作者: changbaihou 时间: 2013-9-1 07:58 标题: 悬浮细胞球的免疫染色方法

刚接触悬浮干细胞球的培养，想请教一下对于这种细胞的免疫染色，有几种方法？- _' O( w: W( U. n' G% c
1，直接染悬浮的干细胞球
2，传代，让其贴壁，然后染色# g! i9 y3 ~( O
请问常规方法是什么？还有其它可行的好方法吗？

作者: 千细胞 时间: 2013-9-2 10:47

要效果好点的话还是固定了做切片染色，因为你本身是悬浮培养的

作者: changbaihou 时间: 2013-9-2 10:58

千细胞发表于 2013-9-2 10:47
: s T5 n2 k9 V: B- @要效果好点的话还是固定了做切片染色，因为你本身是悬浮培养的

0 F- N, ^; G) q1 w! R
多谢，请问可以说具体些吗？
怎么操作？

作者: 千细胞 时间: 2013-9-3 09:11

Samples of cell aggregates were made into frozen blocks by fixing with 4% (wt/v) paraformaldehyde for 30 mins and then with 30% sucrose at 4uC overnight.

作者: changbaihou 时间: 2013-9-3 10:38

千细胞发表于 2013-9-3 09:11 0 z2 B$ K/ e# G1 Z( F
Samples of cell aggregates were made into frozen blocks by fixing with 4% (wt/v) paraformaldehyde fo ...

多谢回复，然后呢？怎么用OCT包埋？5 |$ c e8 G& l6 o* }+ x9 M7 u, J
请问哪里可以找到protocol啊？

作者: 细胞海洋 时间: 2013-9-4 10:15

回复 changbaihou 的帖子 p) B6 ]) b5 N0 |! W. z& i

你回复谁就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容像我这样

否则他会看不到

作者: 细胞海洋 时间: 2013-9-4 10:15

回复千细胞的帖子
+ t( ]5 x+ B+ g. @5 N2 ]2 W U/ |
看5楼

作者: changbaihou 时间: 2013-9-4 12:44

本帖最后由 changbaihou 于 2013-9-4 12:45 编辑 + H9 E9 i# T9 Z

changbaihou 发表于 2013-9-3 10:38
/ ?8 n6 Y. c6 p多谢回复，然后呢？怎么用OCT包埋？
" V) V% M, A4 v# ]1 g5 D请问哪里可以找到protocol啊？

Preparation of neurospheres for cryostat sectioning and immunocytochemistry:

Procedures have been developed to section intact neurospheres. * z# W5 r- l& X$ G$ T: x6 k" {4 L
8 N! p* C5 \2 l6 R* J, U" O5 @
1. Transfer the culture medium with neurospheres to a 50 ml polypropylene conical tube.
2. Allow the neurospheres to settle by gravity (approximately 30 minutes. The time for the neurospheres to settle is dependent on the size of the neurospheres.' |1 E9 m, W' r2 f! ]

Caution
Centrifugation of the viable neurospheres will alter the shape of the neurospheres.3 \. @4 d3 H8 V

3. Remove the supernatant, add and mix gently with 2.0 ml of 4.0% phosphate buffered paraformaldehyde (fixative).4 S. J. M# }, }+ `& r
4. Allow the neurospheres to settle in the tube.! b) |5 z( |, p4 F; ~; A
5. Remove the fixative supernatant with a Pasteur pipette and rinse with 5.0 ml of phosphate buffered saline (PBS). {3 Y/ P$ O0 O8 v/ ?
6. Allow the neurospheres to settle for at least 30 minutes before removal of the PBS.* j- x( U# c/ V5 o
7. Repeat the rinsing procedure at least 3 times.
Immunocytochemistry may be performed on intact neurospheres at this stage.0 i- J- @% F2 e% @; Z7 E
TIP: Observing the removal of the supernatant at any step under the dissecting scope ensures maximum withdrawal of the fluid without disturbing the cell pellet.
8. Remove the final PBS rinse and add 5.0 ml of 30% sucrose (dissolved in 0.1M PBS).
9. Transfer the tube to the fridge and allow the neurospheres to settle overnight.
10. Remove the 30% sucrose and add embedding medium for frozen tissue specimens for 1 hour (Sakura Tissue-Tek O.C.T. compound, cat. no. 4583)( c+ T8 z+ J1 s
11. Prepare the cryostat chuck with a layer of O.C.T.
12. Transfer the neurosphere pellet to the O.C.T. layer on the cryostat chuck.. ?9 W' e( `5 j
, I+ a8 W6 \6 g" m6 O* Y
Caution
You can lose the neurosphere pellet quickly during the transfer of the pellet from the tube to the cryostat chuck. With a Pasteur pipette or an 1000 μl Eppendorf pipettor (using the blue tips) pre-load a small amount of O.C.T. into the tip and then withdraw the neurosphere pellet into the tip, continuous with the pre-loaded O.C.T. Try not to induce any air bubbles into the O.C.T.

13. Cut sections at desired thickness and collect on APTEX (3-Aminopropyl) triethoxy-silane) (Sigma cat. no. A3648) coated glass microscope slides.$ n. L H+ ~! m# X9 z) X
14. Continue with the desired immunocytochemical procedure (non-specific blocking, application of primary antibody etc.).

作者: bin 时间: 2013-9-4 14:00

回复 changbaihou 的帖子
" e3 k8 t& x& f. @2 ~; C" A
悬浮细胞球的染色比较复杂，但是方法也很多，起码有一点是可以肯定的，不能直接然悬浮的细胞球。我以前做皮肤干细胞的时候，他也是一种细胞球，我们是将培养好的细胞球接种的用PLL或Laminin包被的玻璃片上，精确把握贴附时间，这样细胞球就可以以最下的几个细胞贴附于玻璃片上，再染色就可以了，但是整个过程一定要小心，细胞球很容易掉下来的。这个方法适用于球不大的细胞，如果细胞球很大，抗体可能无法进到中间的细胞里，这样染出来的球会发现中间的黑的，这个时候就需要对细胞球做切片了，然后再然冰冻切片，这个要求细胞球有一点的大小，起码眼睛能直接看到，不然你根本就不知道切到目标部位没有。希望能对你有所帮助。

作者: changbaihou 时间: 2013-9-4 14:15

本帖最后由 changbaihou 于 2013-9-4 14:21 编辑 5 ^" G0 i1 B% t2 N, k6 y- k* }! f

回复 bin 的帖子2 ~' I3 ~ } y. m0 {

非常感谢，请问您尝试过让细胞贴壁然后再染色吗？

据说可以直接把整个细胞球放入，1个小时后就爬满底部了。

作者: yuanshenyewu 时间: 2013-9-4 18:52

我也养这种球，很是郁闷，免疫荧光效果不是很好，散光一片。免疫组化的话，那么小个球能切么？

作者: yuanshenyewu 时间: 2013-9-4 18:53

我养的球才100微米，肉眼刚可以看到，楼主养的球多大啊？

作者: changbaihou 时间: 2013-9-4 23:24

回复 yuanshenyewu 的帖子
( z- v, s* b0 v8 U
我养的第三天开始成球，很快超过200um，然后就开始互相融合、中间开始坏死。

作者: yuanshenyewu 时间: 2013-9-5 21:17

中间坏死是怎么看出来的呢？被包在里边，我原来一直以为是保护里边的重要细胞呢

作者: changbaihou 时间: 2013-9-5 21:48

回复 yuanshenyewu 的帖子
+ F/ J/ |# r1 z8 N+ D
中间的细胞由于团块过大，失去营养而坏死发黑，失去正常的结构和折光性。

作者: bin 时间: 2013-9-11 13:32

回复 changbaihou 的帖子

我不知道你说的细胞贴壁是指什么，细胞球可以贴在玻璃片上，如果时间太久球中的细胞就会趴下来，但是时间不够的话在染色的过程中细胞球很容易掉，所以贴壁时间是非常关键的，我以前做的时候是不加血清，贴1-2个小时细胞球就可以贴好，但是有些细胞已经开始爬下来了，你可以在一个玻璃片上贴很多球，最后拍照片的时候拍好看的就可以了。

作者: changbaihou 时间: 2013-9-11 14:14

回复 bin 的帖子

多谢，我是想让细胞球消失，细胞在片子上贴成一层。7 L& y5 h' q O7 H$ o5 \

看来不需要充分吹打细胞球，把他们分散成单个细胞，他们会离开细胞球，自己往片子上爬。

作者: 小渝 时间: 2013-9-12 11:52

回复 changbaihou 的帖子0 l+ R! z& W+ k$ Q" c. B) e

我试过，通过包被玻片然后是细胞球贴壁，关键是看什么细胞，我的是神经干细胞球，大概2h左右，如果太久细胞球就散开了，如果太段贴壁不牢固，在处理中很容易掉

作者: wujian 时间: 2013-9-12 16:04

做免疫荧光也是不错的选择吧

作者: 初来乍到者 时间: 2014-5-2 19:55

回复 bin 的帖子9 A( \! N0 _. s/ s+ [

用PLL或Laminin的玻璃片是什么样玻璃片

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