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标题: 表达载体构建-请教-大家都进来给点建议啊 [打印本页]

作者: Andyhigh 时间: 2013-9-2 10:39 标题: 表达载体构建-请教-大家都进来给点建议啊

最近构建了一表达载体，载体图谱如图（pET28a）
* h* A8 c& p+ `/ ]+ G4 T
自己在Hind III  和 Xho I  加入了  目的基因CDS区(去除密码子)+九聚精氨酸（9R，一种穿膜肽）转化进BL21（DE3）用IPTG 诱导表达
试验目的：生产出带穿膜肽和标签的目的蛋白，标签的目的是方便纯化

[attach]55153[/attach]

问题：
1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？想确定下9 U) M2 U4 V& ?# d( G
2. 自己构建的载体：在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His  和一个T7）??? 5 x3 M- N, o" f6 a
3.  原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？  还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？
4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译？如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列（如后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。+ Y; Y+ _6 |# l3 d% b

自己是新手，望各位高手解答，谢谢了！！！

作者: Andyhigh 时间: 2013-9-2 10:44

图谱

图片附件: 图片2.png (2013-9-2 09:57, 123.01 KB) / 下载次数 85
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTUxNTN8N2FlYzQ2ODR8MTc2NTkzMzgwNHww

作者: Andyhigh 时间: 2013-9-2 10:59

真心想知道自己构建的载体是否存在问题，纠结当中！！！

作者: neuralstem 时间: 2013-9-6 22:55

回复 Andyhigh 的帖子& q b) L& X. a

看不清你的图。简单回答一下你的问题吧
1. 不明白你为什么纠结这个
2. 如果HIS和T7在N端，那么从ATG开始表达。如果HIS在T7的前边，那HIS就不表达（因为没有ATG）。 C端的那个HIS是在STOP CODON的前边还是后边？如果前边就表达，后边就不表达。% C; D/ `+ D) i' \3 ?' k: B
3. 原核的没做过不清楚. f1 T B0 K# t9 A8 q
4. 你应该在你需要的蛋白+TAG之后加上一到两个STOP CODON，比较保险。否则C端不知道会出来什么怪东西

作者: 86964109 时间: 2013-9-11 09:19

回复 Andyhigh 的帖子- } |1 j! M5 V9 X* y* v

“去除密码子”？你是想说去除了终止子吗，

转录是从第一个ATG开始的，Hind III 前的NdeI和NheI都有ATG，因此如果按照你的插入位置，转录是从前面开始的，所以你要注意数清自己的ATG位置，能够通读，不要移码。4 H4 x/ W0 T2 F
* |$ I/ X+ D/ H# I- s
如果不想要目的序列后面的多余蛋白，那就自己加上终止子呗

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