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标题: 精原干细胞移植，求经验高手！ [打印本页]

作者: w343989328 时间: 2013-9-16 15:52 标题: 精原干细胞移植，求经验高手！

本帖最后由 w343989328 于 2013-9-16 15:55 编辑 5 L5 [7 ?' x* k1 T8 @) g5 i% @
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最近论坛里讨论曲细精管注射很火，想趁机请教几个问题，主要关于小鼠受体模型制备方面的。. J3 ^% Q; Q. h$ r/ K2 [
比较经典的方法是：用129×C57杂交F1代作为受体（供体为C57），待小鼠长至6w左右，40mg/kg的剂量腹腔注射白消安。6-8w后，移植精原干细胞。70-140d后分析结果。这样做的好处有：小鼠获得方便（相比于W/Wv小鼠）、避免免疫排斥（供、受体之间有相同背景）、允许定量分析（供体有标记，并且睾丸足够大可以容纳较多的SSC）、最直接的结果判定（交配获得后代）。
但是也有一个很明显的缺点，就是周期长。加起来整个流程要半年甚至不止，万一中间那个步骤出现差错，实验又得重新开始。/ e' ^3 f: b5 |5 N5 w
那么，如果我不需要定量分析，有没有什么方法可以缩短时间呢？这几个问题想请教一下：
1. 当供体是杂合的细胞时，受体是否可以选择纯系小鼠？比如，我用C57×DBA的精原干细胞，移植进C57的睾丸，是否会发生免疫排斥？
2. 是否可以用白消安处理孕鼠，雄性仔鼠作为模型？是否会致畸？
3. 新生鼠或未性成熟小鼠，其sertoli细胞仍会继续生长，就是说精原干细胞的niche还会继续增多。有文章称，此时打进外源SSC，可以和内源SSC竞争niche，所以不需要消除内源性SSC。但是我没有找到相应的paper，想求助诸多战友是否有人做过。还有，很久之前看到，有药物可以促进sertoli细胞增长，可以促进外源SSC的归巢效率，不记得在哪看到了。。6 j; w2 }) z2 t9 B! u
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另外，还想请教下，有人移植过PGC进小鼠睾丸么？

作者: 490096812 时间: 2013-9-16 17:28

问题1.我们都是用的普通昆白小鼠进行移植，影响不是很大，如果不是发影响因子很高的话不用考虑。6 W2 m) S0 [' s' U3 d" p5 @6 D
2.有文献报道称白消安处理后母鼠会流产，估计不行
3.白消安处理另一个好处就是它能够腾出足够的空间去载入你打入的量，如果白消安不处理你很难打入10ul的体积的。7 m& J# t. k3 U9 J- g: C \
注，你如果是研究归巢的话不用等到70-140d，一个月就可以了，这样看来也用不了多长时间啊
目前PGC移植进入睾丸和卵巢组织都已经有文献报道过了，大部分主要是研究多能性的，很多移植的OCT4-GFP小鼠的供体细胞。

作者: w343989328 时间: 2013-9-16 17:35

回复 490096812 的帖子
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其实我移植的就是OCT4-GFP，我估计是杂合细胞表达量很弱的缘故，在供体睾丸的切片都看不到GFP，所以打算受精看胚胎，所以起码2个月啦。
我不想打白消安主要是因为时间久，打入多少只量是技术问题。不知道像上面说的可不可行。+ e/ t- a9 N( K8 S$ X" V
平台建设好了什么老鼠应该都是一样的，你们的供体是什么品系？

作者: 490096812 时间: 2013-9-16 20:21

1.我们的供体是细胞系，验证基因的功能
2.你移植前分选没有？另外后期的检测是做的冰冻切片吗？# L0 {4 Y0 a! k) i" h, G9 V
3.你如果移植的量不够或者是细胞数目不足的话，很难在后期检测到荧光的。

作者: w343989328 时间: 2013-9-17 00:43

回复 490096812 的帖子. k3 r6 W A0 Y+ U
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供体是细胞系，那也有遗传背景吧？你们应该不会那昆白的SSC来研究基因功能吧？: J6 K3 Q% ~, `* G _6 Y
我也是要验证基因功能的，体外培养精原干细胞，上调/下调某基因的表达量，再做移植。如果能有ACT-GFP的供体，那就再好不过了，whole-mount进行定量。如果没有那就只能冰冻切片了，但是现在OCT4-GFP的供体睾丸中找不到GFP。原因可能像你说的，细胞数目不够，OCT4-positive的细胞在成年小鼠中所占的比例非常少。所以我想让受体去和母鼠交配，看看胚胎能不能表达OCT4，只求一个定性的分析。我在看文章的时候看到说，打进新生鼠睾丸里，可以不用消除内源性SSC，如果这样是可以的话起码能省我3个月的时间。只是我没有找到对应的PAPER，不敢轻易去尝试啊。

作者: lfate 时间: 2013-9-17 08:24

一般大家注射SSC是多少体积呢，是上面提的10ul么？或者说细胞量

作者: w343989328 时间: 2013-9-17 09:14

回复 lfate 的帖子- h( X% N! [- @& S j0 G- A
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主要是看受体小鼠的品系和年龄，像最上面说的那种情况是：细胞重悬为10^7/ml，打10ul就是10^5cells。

作者: POPOLD 时间: 2013-9-17 09:16

请教个问题，有什么比较好的分选单倍体的方法

作者: w343989328 时间: 2013-9-17 09:17

回复 POPOLD 的帖子
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单倍体精细胞？

作者: POPOLD 时间: 2013-9-17 09:29

回复 w343989328 的帖子6 P# ?' X% ^2 V1 g+ Z: y

是的

作者: w343989328 时间: 2013-9-17 09:41

回复 POPOLD 的帖子

没做过~~我知道流式可以分析~~想来应该也可以分选

作者: 490096812 时间: 2013-9-17 09:56

回复 w343989328 的帖子8 V% ]$ P4 O. ^+ }& G- {) n, M. j
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1.供体细胞最好是同种模型的小鼠，（细胞系都是c57或者babc啥的）小鼠的免疫排斥很低的，而且睾丸时免疫豁免区，所以我认为不太用过多纠结遗传背景

2.你的oct4-GFP供体睾丸中都没有GFP（你的把小鼠严格的鉴定一下）我们的很亮的。目测你的OCT-GFP小鼠不行了。
3.你要是跟母鼠交配的那种方法去鉴定的话，半年我觉得都做不完啊。那就跟鉴定转基因小鼠一样了超级麻烦2 x7 |. J( p, |( F
4.你考虑供体和受体遗传背景的问题是非常严谨的，后来你又为了省几个月的时间而不去严格按照干细胞移植的流程操作，本末倒置

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个人观点，求同存异

作者: POPOLD 时间: 2013-9-17 11:35

回复 490096812 的帖子- n( `6 w) \" Z4 L9 Q! G
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您好 1 您做过分化后的精原干细胞，单倍体细胞。进行单倍体注射卵母细胞么6 \( w) R2 e3 A& H; Q+ A+ V

作者: 490096812 时间: 2013-9-17 12:52

回复 POPOLD 的帖子/ c6 S& y" N2 g/ F5 m
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1.我没有做过，我们这里没有这项技术平台。不过好多文章都做过，我也是很想做啊

作者: w343989328 时间: 2013-9-17 13:08

回复 490096812 的帖子

我知道日本有个团队有体外组织培养做出体外成熟，发了nature，除此之外还有吗？

作者: 490096812 时间: 2013-9-17 13:28

回复 w343989328 的帖子

去年发过一篇亚洲男科的，说是也是诱导成精子样细胞了

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