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标题: 引物设计是否正确 [打印本页]

作者: 小兔子lp 时间: 2013-10-9 16:00 标题: 引物设计是否正确

本帖最后由小兔子lp 于 2013-10-9 16:04 编辑 3 m8 X9 Y3 y' ]$ m# Z3 h; s

提取了RNA，反转后想扩增Pdx1基因，之后连接到病毒表达载体包装病毒。pdx1的CDS序列如下：5’-ATGAACAGTG……ACCCCGGTGA-3’。( N3 o. L1 G/ j9 e- P7 j6 r
上游引物直接设计为：5’-ATGAACAGTG]-3’1 o: K$ K/ ]: D. M" o
下游引物直接设计为：5’-[TCACCGGGGT-3’(ACCCCGGTGA的反向互补序列)
请教各位，这样就可以了吗？这样设计就用不到PP5软件了呀！

作者: murong 时间: 2013-10-9 16:52

Tm值和加了酶切位点后的Loop Tm值都要用软件看下多少啊，上下游Tm值差异最好不要查过5度，loop Tm值最好不要超过40

作者: 小兔子lp 时间: 2013-10-11 14:58

本帖最后由小兔子lp 于 2013-10-11 14:59 编辑 3 ]: J$ J: O' H; j5 z

回复 murong 的帖子
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验证引物是否可用是确实用了软件，可是在设计引物时就用不到软件了呀~我将CDS区复制进PP5,软件设计出的引物和我手动设计的这个也不一样啊，这是怎么回事呢？望指教

作者: biovictor 时间: 2013-10-12 14:53

回复小兔子lp 的帖子; x4 L+ F& F0 l
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妹子呀！设计引物重点不是看你能否将设计的引物正好配对上去，重点是要看如下几点：
（1）希望将自己的PCR产物连入载体中，是不是要解决酶切位点的问题。如果不用软件，随便弄两个酶试一下，万一他们的识别位点在你的基因序列之内，怎么办？那不就切烂了吗！
（2）不用软解分析，假如使用的酶在序列中没有酶切位点（走大运了！），但是保护碱基添加的数量或者酶切位点序列的添加不对，造成移码突变，等你连到慢病毒载体上，就是不表达蛋白，那就洗洗睡吧！8 G9 L9 a3 P$ x* {7 V
（3）万一自己的实验需要某种标签，来指示自己蛋白的成功表达，可惜妹子没有在意基因序列之后标签蛋白的感受，自己弄一个就可以了，如果造成后面蛋白移码突变，标记就在也不想理你了！所以要学会使用它呀！可以多问问你的师兄师姐。

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