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标题: 小鼠睾丸冰冻切片（方法探讨） [打印本页]

作者: 20111109 时间: 2013-10-12 14:36 标题: 小鼠睾丸冰冻切片（方法探讨）

我们实验室冰冻切片的通常步骤是新鲜组织直接加OCT包埋，切片，然后风干，4%PFA固定切片。

但是，由于最近做的这个抗体一直做不出荧光信号，（这个抗体是在文章里选出来的，他们在睾丸里面做出了荧光信号来）

我又发现文章里冰冻切片的方法是：先用4%PFA固定2h，然后用OCT包埋切片的。

我先问的是：这个先固定再切片的方法中间需要用蔗糖来梯度脱水么？如果有人做过，可否来分享交流一下子呢？9 a. x1 F1 |1 V2 p* g/ b% N
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万分感谢呢。

作者: w343989328 时间: 2013-10-12 15:12

先包埋切片，不用脱水，直接固定即可。

作者: aminhair 时间: 2013-10-12 15:45

你是哪个大学的啊?

作者: 20111109 时间: 2013-10-12 16:39

回复 w343989328 的帖子" s a* f# n0 o$ r
: @0 V8 T6 z% s+ j- j
你说的就是我们实验室的常规方法哎。。。。我想知道先固定再脱水的方法呢。。。

作者: 20111109 时间: 2013-10-12 16:40

回复 aminhair 的帖子* A! a9 J, i: ]! a" b

nanjing medical

作者: lyj-0017 时间: 2013-10-12 22:56

回复 20111109 的帖子
7 g0 V# _8 |6 V1 L5 L7 d) g
我们以前是取新鲜睾丸先泡福尔马林固定过夜，进行切片前，通过梯度浓度的蔗糖液脱水，然后使用OCT包埋，切片，风干。但是，这样切出来的片子做荧光，不知道会不会受到背景荧光的影响，比如脂褐素发出的背景荧光

作者: moluxingke 时间: 2013-10-13 08:47

我之前做冰冻切片也是这个步骤，新鲜睾丸浸在OCT中，液氮冷冻，然后切片，切片干燥后固定，对于固定剂，我一般选用冷丙酮，PFA固定的组织有时候可能会有自发荧光。 ~8 \' z9 N( ]" h) d. z
根据你的方法，如果取材迅速及时，应该没有什么大问题，只是想知道你用的是什么抗体，有没有试过阳性组织。这种情况很常见，毕竟你们用的抗体和文章中介绍的抗体即使来自同一个公司，但也不一定就是同一批的，不同批次的抗体之间效果都可能会有差异的，建议你在确定抗体有效的情况下，摸索一下抗体孵育条件，比如一抗稀释浓度，抗体孵育温度以及孵育时间。祝好运！

作者: 490096812 时间: 2013-10-14 13:49

本帖最后由细胞海洋于 2013-10-15 09:33 编辑
/ o$ O) l [3 L" i3 F' Z9 w- t, e4 ~
我们实验室的，给你看考一下
固定 将组织置于4%多聚甲醛固定液中，4℃摇床过夜。 漂洗 将固定后的标本用1X PBS漂洗三次，每次15分钟。 脱水 将组织置于30%蔗糖溶液中，4℃摇床过夜。第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全。 4 A( r+ L% k+ Y- W' T, }0 L% V5 i8 U
包埋 将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记。之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀，切忌起气泡，静止10分钟，以防切片时脱片。重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中。在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。

作者: houbara 时间: 2013-11-14 17:17

不出信号的原因很多应该系统考虑.# `4 d8 A: J4 M& D
以上面的处理程序,抗原完全失活可能性不大.$ P5 J' N& q2 H& U3 q: `2 [" T
关键是对照组要设置好,否则因素太多,很难排除.

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