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标题: 脐血单个核细胞分离出现很多白色沉淀的问题 [打印本页]

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 09:06 标题: 脐血单个核细胞分离出现很多白色沉淀的问题

用Ficoll法分离脐血单个核细胞，吸出白膜层离心后，离心管底有很大一块白色沉淀（明显细胞没有那么多，大概是平时细胞沉淀的3倍），洗涤接种到培养瓶中后，镜下看到底部有一层白色东西，细胞点缀在上面；高倍镜下观察，底部的白色东西也是小圆透亮，以前没有出现过这种情况，请问大家遇到过这种情况吗？是什么原因造成的呢？

作者: wind789 时间: 2013-10-23 09:36

本帖最后由 wind789 于 2013-10-23 09:38 编辑
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难道是Ficoll密度不标准，血小板吸起来了？

作者: lyj-0017 时间: 2013-10-23 09:49

无图无真相

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 10:30

回复 wind789 的帖子

Ficoll一直都在用，之前没有出现过这个问题，也怀疑过是不是血小板，但洗涤的过程中怎么一点都没有洗掉呢，困惑……

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 10:33

回复 lyj-0017 的帖子; d) P; C* o5 G* z+ {9 [

有拍的照片，但不知如何上传

作者: sdudai 时间: 2013-10-23 10:36

我也出现过这种情况，应该是细胞碎片和血小板。

作者: sdudai 时间: 2013-10-23 10:55

是类似这个样子的小圆圈么还是其他的样子？这样子的话你的结果可能的原因就是细胞碎片和血小板了，你最好附一张图片。

图片附件: 小圆圈.jpg (2013-10-23 10:53, 57.16 KB) / 下载次数 200
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTYzNjF8YTc4MWQwNTZ8MTc5MzExNTM1NXww

作者: mmssyyee 时间: 2013-10-23 11:08

是不是ficoll的时间长了？

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 11:11

1IW)X0TOR~2]@R0APC]67.jpg

附照片一张，请大家指教。

图片附件: 1IW)X0TOR~2]@R0A$6PC]67.jpg (2013-10-23 11:10, 88.95 KB) / 下载次数 224
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NTYzNjJ8MjcyYTEzYmJ8MTc5MzExNTM1NXww

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 11:20

回复 mmssyyee 的帖子

Ficoll什么的都是在保质期内，而且后来又用相同的Ficoll操作过，没有出现相同的现象。但是从操作上面也没有发现问题，实验条件也是一样的，不知道是不是血的问题。

作者: lyj-0017 时间: 2013-10-23 11:53

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& K7 A. |6 ]9 |, k+ X- j0 }. I
确定这一次做密度梯度离心的转速都与以前相同吗？另外，能否说一下你吸取白膜层的具体操作？该图看上去像是血小板过多！

作者: feifangli 时间: 2013-10-23 13:23

本帖最后由 feifangli 于 2013-10-23 13:23 编辑 $ K, r. `# B: F

可能是操作中的问题。

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 13:42

回复 lyj-0017 的帖子

是的，转速都是一样的，吸取白膜层时为了避免丢失，在白膜层的上下液面都会多吸一点，和之前的操作也是一样的。如果是血小板的话，细胞培养的过程中会慢慢消失吗？

作者: lyj-0017 时间: 2013-10-23 14:27

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应该就是在上面多吸的那一点点的问题，血小板在以后的培养过程中应该是可以慢慢裂解掉的，就跟单个核细胞中的单核细胞、巨噬细胞会死掉一部分一样，但是也不能忽视一个问题就是，血小板中含有一些凝血因子，不排除会使细胞聚集的可能，个人理解啊~

作者: tianangelt 时间: 2013-10-23 15:25

回复 lyj-0017 的帖子2 `5 l+ Y# Y2 g4 p- R/ _

平时分离偶尔也会有一点杂质，但那次分离超级多，后来细胞转移到另外一个瓶，培养了一段时间，没有加因子，只加了点血浆，细胞生长状态挺好的。

作者: zsc78 时间: 2013-10-23 22:21

先检查一下Ficoll里有没有类似的东西或者是否过期。再检查自己在实验操作过程中是否有问题或污染。

作者: gzeb 时间: 2013-10-24 16:20

看图似乎白色物挺多的，试试低速离心能否除去，少量杂质没什么影响的。还有这个应该跟你的操作有点关系，一般在梯度离心完吸取的时候要特别小心，就吸取中间那一层细胞，也许你为了能得到更多的细胞而多吸了其他一部分溶液，这样反而带入更多的杂质，如果离心效果好，杂质少，效果不好，就是你这种情况

作者: tianangelt 时间: 2013-10-24 16:48

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最近Ficoll离心完后的白膜层，和上层液面的分界很明显，但和下层没有明显的一个界面分层，偶尔有分界比较明显的。这个是操作的原因吗？每次的转速都是一样的。

作者: gzeb 时间: 2013-10-25 08:42

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你转速多少，多长时间？

作者: tianangelt 时间: 2013-10-25 12:36

回复 gzeb 的帖子2 y6 b! g; u W3 U
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2500rpm，20min

作者: gzeb 时间: 2013-10-28 09:25

回复 tianangelt 的帖子
/ l+ c# R, t" q# |" O" P. p
这两天有事，没上来，转速过高了，2000rpm足够了，我们这是2000rpm，20min；不同实验室，离心机不同可能会有差异，不过相差500，还是偏高了

作者: YUENANYUE 时间: 2013-12-10 14:07

回复 tianangelt 的帖子
* \7 ]5 a2 y& g* A
现在我也出现这个问题，不知道您是不是已经解决血小板的问题了呢？

作者: tianangelt 时间: 2013-12-10 15:39

回复 YUENANYUE 的帖子7 u: E! E! d3 K7 C' E# u
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这种情况是偶尔出现，发现培养一段时间以后就会慢慢消失，如何从源头上控制，还没有找到好的方法

作者: 君鸿 时间: 2013-12-11 10:00

这种情况我遇到过，这是粒细胞，吸白膜层的时候尽量不要吸到，对培养有一定影响，严重时可造成细胞成团装。

作者: tianangelt 时间: 2013-12-11 12:48

回复君鸿的帖子: |% W$ H, ]. l6 X5 a! e: C5 ]
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您好，能详细说一下吸白膜层的时候需要注意哪些吗？有时候细胞确实会成团生长，但是过段时间就分散开了。谢谢。

作者: 大少爷 时间: 2013-12-11 22:53

本帖最后由细胞海洋于 2013-12-12 07:52 编辑 9 ?( w7 G4 h6 G+ [( g
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纠结啥呀，直接把这份细胞废弃呀

作者: Ernest 时间: 2013-12-13 12:00

这像是污染了

作者: Ernest 时间: 2013-12-13 12:02

脐血采集到制备的时间有多长？有无凝血或出现大的血块？我估计是脐血放置的时间太长了

作者: tianangelt 时间: 2013-12-14 08:47

回复 Ernest 的帖子
9 c: O. l5 C) p/ N" \
这个倒没有，从采集到制备，不超过两个小时，也没有出现凝血。你说的有凝血会出现这种现象吗？为什么呢？

作者: tianangelt 时间: 2013-12-14 08:48

回复 Ernest 的帖子
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没有污染，做无菌检测没有问题。

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