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标题: CIK细胞污染 [打印本页]

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 10:30 标题: CIK细胞污染

我最近开始养CIK细胞，两次培养都在接种第二天后发现杆状物存在，能够运动，仔细观察发现其实是扁平椭圆状，侧面为杆状，怀疑是细菌污染，但是48小时培养液颜色依旧没有明显改变，取24小时培养液进行细菌培养，目前已经18h，还没有肉眼可见菌落，不知道是否为细菌污染？是什么污染？还有血小板在培养液中是什么形态？体外能否增殖？请各位大侠解答疑惑。" X! g9 Z% g2 V* [. r6 `" s' p
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作者: zhoufan025 时间: 2013-12-12 10:38

我也遇到了同样的问题，求解

作者: 各输己键 时间: 2013-12-12 10:41

是不是大家一直提到的黑胶虫污染？显微镜下仔细看看，是不是都还在运动的？

作者: zhoufan025 时间: 2013-12-12 10:56

回复各输己键的帖子0 \, w3 K/ q7 o" W
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是可以运动的，请问黑胶虫污染怎么检测呢？一般来源是标本还是操作？

作者: YUENANYUE 时间: 2013-12-12 11:40

能判断出是黑胶除污染吗？我也出现了这个问题，不过现在细胞貌似长起来了

作者: ciweiyuan 时间: 2013-12-12 12:35

应该是血清里带的胶原虫吧，把血清过滤会好点

作者: ciweiyuan 时间: 2013-12-12 12:41

血小板形状不规则，一般呈圆形，比红细胞和白细胞小得多，无细胞核，有质膜，是由巨核细胞破裂而成的所以它应该是不能增殖的。

作者: lyj-0017 时间: 2013-12-12 15:01

回复 mtdj1314 的帖子8 i7 i$ h  }) Y/ e

      24小时内细胞悬液没有变浑浊，一般可以排除细菌污染；霉菌污染的话48小时应该可以观察到；至于支原体污染，常规手段很难监测到。血小板是终末分化细胞，一般无法增殖，在72h之内应该都是可以自行裂解掉的。+ [1 y! l9 V# ^$ m
   你应该是在培养开始时加入胎牛血清了吧？有些动物血清中就会含有一种所谓的“黑胶虫”，这不是个人的问题！你完全可以使用无血清培养基进行培养。

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 15:09

回复 ciweiyuan 的帖子3 H/ R6 l$ N. m( e- D: @; o" i2 O( w

我用的是自体血浆，没有使用动物血清，那是否说明自体血浆里面存在胶原虫？这个虫子有什么特点？如何鉴定和去除呢？

作者: ciweiyuan 时间: 2013-12-12 15:14

据说什么黑胶虫也好胶原虫一旦发现污染很难很好的去除，我以前有碰到过类似这种的就开始清理消毒灭菌实验室培养箱，我真没有好的办法，不知道其他牛人有没有什么好的方法

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 15:15

回复 lyj-0017 的帖子, y# V- N" G+ `0 @

接种后24h观察，培养液轻轻晃动有一层细沙状物质，怀疑是细菌污染，但是为何培养液经18h培养后却没看到菌落？黑胶虫该如何去除呢？我使用的是自体血浆，只是没有经过56°C灭活补体，人体自身会携带黑胶虫吗？

作者: lyj-0017 时间: 2013-12-12 15:26

回复 mtdj1314 的帖子

1、你说的培养液经18小时培养是在平板中培养的吗？
2、我们以前也遇到过黑胶虫，当时我们的老实验技师也说没有什么好的办法，现在也不知道有什么好办法。
3、既然用的自体血浆，为何不灭活补体呢？大家通用的方法你们为何不去做呢？再说也不麻烦啊。
4、人体自身携带黑胶虫这个还真不清楚，但是黑胶虫这个问题貌似也没有一个确切的说法说明其到底是什么。

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 15:33

回复 lyj-0017 的帖子 f* Z5 Y6 M" O
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是的，平板培养的。自体血浆灭活的话能消除黑胶虫吗？

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 15:42

回复 ciweiyuan 的帖子

确实是比较棘手的事情呢，谢谢你宝贵的经验

作者: ciweiyuan 时间: 2013-12-12 15:59

回复 mtdj1314 的帖子7 ~ g5 Z* S! s: P7 ?: b

不客气，期望你实验顺利

作者: cjq12862 时间: 2013-12-12 17:39

除了楼上各位同行的推测，还有一个可能性：寄生虫污染，建议楼主立即找出污染源，环境消毒后重新培养。

作者: lyj-0017 时间: 2013-12-12 17:43

回复 mtdj1314 的帖子- D+ s# b; z5 e- [

不清楚灭活能不能消除黑胶虫。
另外，能否大体介绍一下你是如何制备外周血单个核细胞的？前期处理也不能排除

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 20:45

回复 cjq12862 的帖子
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寄生虫污染？可是两个标本是不同个体来源的呀

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-12 20:47

回复 lyj-0017 的帖子

前期处理采用PBS稀释血液，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，然后再PBS清洗2遍，接种入培养瓶，应该是没有问题的呢

作者: future007 时间: 2013-12-12 21:05

做CIK治疗不是一般都需要第7天的时候送检验科做细菌培养和其他污染源检测嘛

作者: cjq12862 时间: 2013-12-12 22:37

传说的黑胶虫没那么大

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-13 09:17

回复 future007 的帖子- m6 N9 w$ M# y+ H6 N+ X

24h培养液细菌培养和真菌培养已经48h，结果是阴性的

作者: Ernest 时间: 2013-12-13 12:12

"扁平椭圆状，侧面为杆状"听你描述有点像是红细胞1 K- n m2 B7 K% Z* j0 l
你说的运动是原地运动，还是线形运动？
如果是原地运动的话，有可能是细胞碎片或红细胞在做布朗运动，而非微生物污染。( s+ _4 O4 p1 O3 ^+ g7 i
布朗运动(Brownian motion)是悬浮在液体或气体中的微粒所作的永不停息的无规则运动。

作者: 水珠 时间: 2013-12-13 13:11

我们也经常遇到过这样的问题，但是并没有影响细胞的生长；细胞样本检测，细菌真菌支原体都是阴性的，而且细胞状态还很好！

作者: luyue6453 时间: 2013-12-13 14:10

回复 mtdj1314 的帖子1 h5 O3 Y- V* k1 x i% C

从头看了这些评论，总感觉不是污染，你要是细胞已经生长了，应该不是污染，如果污染了细胞怎么还能增殖呢，你看着动你确定吗，一般在无菌室里有中央空调，显微镜放在桌子上会有微动的。你再仔细观察一下。

作者: 星火燎原 时间: 2013-12-13 19:01

回复 mtdj1314 的帖子
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没事的，养一养就好了，没洗干净的缘故，更何况你加了自体血浆，杂质太多，接种密度合适的话，细胞一样会很快长起来的。

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-14 08:52

回复 Ernest 的帖子5 r0 P9 L6 X0 P7 j4 s

是原地运动，但是奇怪的就是，第一次，我以为是细菌，把培养液用0.2um滤器过滤了，镜下观察没有发现其存在，但是4h后，又发现了大量的该物质，说明其能增殖，但是体外红细胞应该是不能增殖的吧，所以就解释不了，现在已经培养第4天了，该物质有破损迹象，但是又发现了不少黑色的小小的，能动，，类似传说的黑胶虫，我真是头大了，都不认识

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-14 08:56

回复水珠的帖子
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真的吗？你们也是在养CIK中发现的吗？那这就是一种正常现象了咯？我感到奇怪的就是，刚接种的时候没有看到这个物质，但培养第二天就能发现很多，滤器过滤培养液后，培养基很干净（细胞是离心沉淀了的），但是培养4h后又能发现很多，说明其能增殖

作者: lyj-0017 时间: 2013-12-15 11:43

回复 mtdj1314 的帖子* `) n$ Y% a6 P- ?- l" }0 F
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你这是培养的病人的细胞吗？只是一个人的细胞这样还是所有病人的细胞都这样呢？应该把这些物质的来源排除一下，如果这只是一个人的细胞，那你可以换一个人的细胞试试，看看是不是仍然存在

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-16 23:44

回复 lyj-0017 的帖子- \* P0 K6 {4 [( ^* v' w
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不是呢。是脐血，我前面那个感觉也是一样的。有没有可能是寄生虫？

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-17 23:12

回复 luyue6453 的帖子

好的，这次已经扔掉了，再做一次看看，我也很想知道到底是不是污染

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-17 23:15

回复星火燎原的帖子
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真的吗，做了两次，看到后我第一反应都是污染，但是又检查不出来，下次还是坚持养久一点看看，主要是会动的杂质太渗人了，总觉得是虫子似的

作者: neng172 时间: 2013-12-26 12:12

血清药过滤灭活，培养效果更好的

作者: mtdj1314 时间: 2013-12-26 16:06

回复 neng172 的帖子
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嗯，先过滤后灭活比较好

作者: 星空雾雨 时间: 2014-1-17 10:11

回复 mtdj1314 的帖子9 r5 k) p. J- A' y) @5 @6 c0 H

请问用自体血培养CIK ，培养前抽多少ml血，培养过程中加的自体血清还要抽血吗？

作者: mtdj1314 时间: 2014-1-22 09:56

回复星空雾雨的帖子* p6 l: b9 r! z' c$ c, Z/ L: u
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我用的是40ml外周血，分离风血浆足够培养使用，不需要另外抽取血液。

作者: 筱筠 时间: 2014-2-11 10:10

从图片上看，没有什么异样，CIK培养的前四天都会出现那种形态的

作者: mtdj1314 时间: 2014-2-14 14:11

回复筱筠的帖子
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真的么？那最好了，我感觉也是

作者: 孙帅帅 时间: 2014-2-14 14:43

1、那个黑色的碎片就是血小板，即使低速离心去除血小板，但是开始的时候血小板还是会比较多，一般在养CIK的第5-7天就会没有了（具体去哪本人就不知道了，可能是分解了吧）) n: i6 W* L$ q- u ~( `% p* ]
2、你的细胞不像是染菌，应该可以肯定不是染细菌或者霉菌；要是染细菌在那个倍数的显微镜下也就是刚刚能看到一些很小的小黑点（比你图片上的小黑点碎片要小的多，几乎看不清楚）在做布朗运动；并且如果是染菌那么适宜的生长条件，第二天你的培养瓶的培养基会变得很浑浊，不是黄色的透明状态，而是很浑浊，所以应该不是染菌。

作者: wf78365421 时间: 2014-2-16 12:35

回复 mtdj1314 的帖子6 G* G! ? f- ], y9 K, N( x

污染了！扔掉吧！重新从头至尾清洁消毒实验室！
重新采集外周血制备cik吧！

作者: wf78365421 时间: 2014-2-16 12:35

回复 zhoufan025 的帖子

注意无菌操作！

作者: wf78365421 时间: 2014-2-16 12:36

回复 ciweiyuan 的帖子4 K4 r3 _# }* P+ B

“黑胶虫”不是一个科学的概念！

作者: mtdj1314 时间: 2014-2-27 09:57

回复孙帅帅的帖子' P/ g8 n7 W, `# h, H% r: O& o

谢谢你宝贵的意见，我也觉得不是细菌类污染，只是如果是血小板，为何一开始种瓶的时候看不见？在过滤培养液之后也看不见，但是4h后又能看见，感觉是能增殖的某种物质，而血小板是不能增殖的吧，现在还不能确定是什么。

作者: mtdj1314 时间: 2014-2-27 09:58

回复 wf78365421 的帖子0 o" k; P7 O) N2 X, D6 e

嗯，刚开始我也是这么做的，现在倒觉得不像是污染，只是还不能确定是什么

作者: wenwen1228 时间: 2014-2-27 20:07

是不是细胞碎片？

作者: mtdj1314 时间: 2014-2-27 23:22

回复 wenwen1228 的帖子
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感觉不像，形态还是比较均一的

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