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标题:
ips传代
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作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-23 11:46
标题:
ips传代
现在我正在进行IPS的第一代传代，用5ml枪头将克隆挑出，
1 @: v+ U. d1 p
放入1.5ml的EP管内进行机械吹打，吹打2遍之后，肉眼仍
. m6 z: U% ~4 @5 P/ d" b
可见未吹散的细胞团，这么大的克隆怎么能够吹打成小块呢？
6 e# N6 e Y* |* A' ]: R1 C
小块更容易贴附，是吧！
L. g# H$ v: \0 @, s( R
:loveliness:各位高手们，你们怎么做的？
作者:
yuri.2004
时间:
2013-12-23 15:20
你可以先用胰蛋白酶进行一下消化。这个过程要注意消化的温度和时间，注意在倒置显微镜下观察，消化适度后去除消化液，加点培养基，用枪轻轻吹开细胞。然后要经过离心去上清，再加培养基重悬后，分装培养就行了。。 最好有多孔板，方便操作和观察。
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-25 15:06
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yuri.2004
的帖子
& y( @" T# v7 a; A3 M
6 ?; E6 x! ?& g4 ~* w8 M- q
谢谢，第一代的话，我没有采用胰蛋白酶酶消化，
) e* Z3 J% s; K* c7 y
只是挑取，剩下的细胞团还可以继续生长。
5 q( e, @' U0 r' j f9 e( g( \
8 J. w7 h' F/ o3 Z+ B, i& J
我观察了下，贴壁的细胞基本是贴在滋养层细胞上的，所以
' B+ w$ B1 M% _; _
想请问，消化的干细胞什么时候可以不用再铺被滋养层细胞呢？
" n' r b" J3 a/ H5 `
作者:
yuri.2004
时间:
2013-12-26 09:34
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穿裙子的猫
的帖子
4 H) K3 A# Z+ O) J
+ `3 v' [! y5 u, y8 j
按照你的意愿，你也可以把挑出来的细胞加到一个板里进行消化嘛~这样方便一点。
5 R/ u, m, R4 x7 ~% e. [2 W
滋养层细胞都不是必须的~有一种培养是无饲养层的，直接可以养IPS的~我们这边就是用无饲养层培养的。我看过资料，IPS和滋养细胞对酶的消化程度不同，应该是IPS先消化下来吧，你可以核对一下这个。只要把两种细胞分开了 ，直接用不加饲养层的方法，问题应该不大。不过细胞应该会有个适应过程。
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-26 15:57
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yuri.2004
的帖子
# h' F0 F' D+ p7 Y5 k( Z9 O
: W7 `, C h) r
传代后的细胞因为吹打太散了，现在是这样的，边界不清，平面生长，胞浆较大。跟你们的一样不？这像不像分化了的？
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-26 16:05
[attach]58057[/attach]
作者:
孙帅帅
时间:
2013-12-26 16:26
你是转染的肾小球表皮细胞吧，还是不要消化，那样细胞会很杂。以后传代用EDTA消化，不要用胰酶。
作者:
yuri.2004
时间:
2013-12-26 16:33
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穿裙子的猫
的帖子
& |% S2 J# W) {% E: j
8 h4 D% m% }; k4 E
你这个是正在诱导IPS吗？看着更像是诱导IPS过程中的图。还有部分饲养层细胞能看到。中间那些细胞团的确是IPS的样子，现在还看不出来是否有分化的。等细胞团足够大了，如果克隆团中间部分有颜色变深发黑，或者很明显的细胞形态变化之类的，那种是出现分化了呢。
作者:
yuhaoze
时间:
2013-12-26 22:03
这些细胞不是iPS吧，不像
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-27 08:26
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孙帅帅
的帖子
2 d% y3 d3 F/ N
$ M4 q& r/ s7 C+ Z' o. a% e
把肾小球去掉就对了，是表皮里的黑素细胞，
- e+ p, t$ w+ j q
我现在用的胰酶都是**%胰酶/EDTA,用EDTA消化有什么不一样的吗？:D
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-27 08:29
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yuri.2004
的帖子
+ ~; k: A4 w; X2 B. v! x* Z; [5 w( o
$ H) j* y6 W& E: ]7 W
我这个是挑取的克隆，吹打的太厉害了，现在贴壁4天了，
# h: Y( w' o7 z1 {
之前形成克隆的时候，边界就是这样的细胞，中间是克隆
4 @/ i3 S$ i/ M5 T1 J( |' |7 E
样的，我这不会是一边克隆，一边分化把？请指教啊！
0 Y# T. U0 i9 S. Q; h
2 C1 G. `: P6 N# i4 U% d' x8 M4 q
补充内容 (2013-12-27 08:31):
7 e$ V8 |5 K4 H( N+ E8 F# N+ I
另外，那些克隆现在出现了中间变黑的现象，难道真像你所说
的分化
?
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-27 08:30
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yuhaoze
的帖子
# l1 g& G! N& W# b2 f" h$ N
1 @' n$ F+ N v
打击我了！会不会细胞来源不一样，生长形态就不一样，
& K9 E% G0 G Y1 [7 e$ ~
这种细胞我之前做过碱性磷酸酶染色，阳性。
作者:
穿裙子的猫
时间:
2013-12-27 08:33
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yuri.2004
的帖子
/ s9 @1 D# s7 |0 H
) W5 l* g& k, {$ e, C# d
那你是用哪个浓度的胰酶消化呢？一般是0.05%还是0.25%？
作者:
yuri.2004
时间:
2013-12-27 10:07
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穿裙子的猫
的帖子
* y- Z; E1 O% H8 p
0 N7 O: `* S2 c* ~- [, }0 m
你这个应该看不出来是不是分化，细胞太少了。不过也有可能性。检测的话，最好复合检测。比如做做OCT4 SSEA-4检测什么的，这样心里更有底。
( I7 Q i7 _+ g' L
中间的IPS细胞的形态和我们差不多的。我们用的是表皮成纤维细胞做的。酶的话是0.25%的。给你发了个资料书上的干细胞分化后的图，你看看吧~
7 q: O/ \% S# l4 y3 D' ~. B0 K
[attach]58089[/attach]
作者:
孙帅帅
时间:
2013-12-27 13:48
EDTA对细胞损害比较小，消化细胞比较温和，我们消化ES就是用的EDTA
作者:
yuhaoze
时间:
2013-12-27 14:28
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穿裙子的猫
的帖子
4 ~7 d9 n) H4 D) O. [9 }: X: p
3 M5 D" d A0 }. ^; `, r
不会，ES不是这个样。
9 X; N7 t2 S( T9 ?/ f8 U# B
作者:
葱葱
时间:
2014-4-3 16:31
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穿裙子的猫
的帖子
. C3 E$ u9 p, J$ X% T1 `3 }
/ J+ i6 c3 c/ y( l+ n
你的iPS养成了吗？这个图哪部分是？我也在养呢，只是要到了焦虫，郁闷呢。
作者:
Tivah
时间:
2014-4-4 11:19
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穿裙子的猫
的帖子
6 V9 G- w- @+ D9 G/ _2 u
# f! f6 p% Z3 j! f I1 i
我也觉得像是诱导过程中的iPS，普通OSKM感染后6天左右的样子。
作者:
922922922
时间:
2014-4-6 17:54
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yuri.2004
的帖子
& J- u9 V' w! x- P+ W2 V
, c5 Q, f; o5 @. l
请问如果是无滋养层培养，培养液的配方有什么不同吗？
作者:
922922922
时间:
2014-4-6 17:54
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穿裙子的猫
的帖子
( P) e( O; f& F) V- t" _; v, p: k
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貌似有些分化，边缘已经不清晰了。
作者:
922922922
时间:
2014-4-6 17:54
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穿裙子的猫
的帖子
1 W& ]" e4 p2 j: }) d0 N
5 i# k0 n3 s- I
貌似有些分化，边缘已经不清晰了。
作者:
葱葱
时间:
2014-4-8 16:28
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穿裙子的猫
的帖子
9 P/ ]) E8 d! {
2 P. l! {! _% f: ~% L
这像是iPS细胞。我像问一下你鉴定时，用的试剂盒吗？
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