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标题: ips传代 [打印本页]

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-23 11:46 标题: ips传代

现在我正在进行IPS的第一代传代，用5ml枪头将克隆挑出，9 {- i* G" g k4 T( j
放入1.5ml的EP管内进行机械吹打，吹打2遍之后，肉眼仍6 a) f; L( s- L; e
可见未吹散的细胞团，这么大的克隆怎么能够吹打成小块呢？& w8 ^9 k; D$ ~% ^3 L8 f
小块更容易贴附，是吧！& r* F& U' A" K$ l4 `# a
:loveliness:各位高手们，你们怎么做的？

作者: yuri.2004 时间: 2013-12-23 15:20

你可以先用胰蛋白酶进行一下消化。这个过程要注意消化的温度和时间，注意在倒置显微镜下观察，消化适度后去除消化液，加点培养基，用枪轻轻吹开细胞。然后要经过离心去上清，再加培养基重悬后，分装培养就行了。。最好有多孔板，方便操作和观察。

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-25 15:06

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谢谢，第一代的话，我没有采用胰蛋白酶酶消化，
只是挑取，剩下的细胞团还可以继续生长。

我观察了下，贴壁的细胞基本是贴在滋养层细胞上的，所以
想请问，消化的干细胞什么时候可以不用再铺被滋养层细胞呢？* R# O U! U( X ~

作者: yuri.2004 时间: 2013-12-26 09:34

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" X) r# A) b% g% G# X. u
按照你的意愿，你也可以把挑出来的细胞加到一个板里进行消化嘛~这样方便一点。
滋养层细胞都不是必须的~有一种培养是无饲养层的，直接可以养IPS的~我们这边就是用无饲养层培养的。我看过资料，IPS和滋养细胞对酶的消化程度不同，应该是IPS先消化下来吧，你可以核对一下这个。只要把两种细胞分开了，直接用不加饲养层的方法，问题应该不大。不过细胞应该会有个适应过程。

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-26 15:57

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传代后的细胞因为吹打太散了，现在是这样的，边界不清，平面生长，胞浆较大。跟你们的一样不？这像不像分化了的？

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-26 16:05

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作者: 孙帅帅 时间: 2013-12-26 16:26

你是转染的肾小球表皮细胞吧，还是不要消化，那样细胞会很杂。以后传代用EDTA消化，不要用胰酶。

作者: yuri.2004 时间: 2013-12-26 16:33

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你这个是正在诱导IPS吗？看着更像是诱导IPS过程中的图。还有部分饲养层细胞能看到。中间那些细胞团的确是IPS的样子，现在还看不出来是否有分化的。等细胞团足够大了，如果克隆团中间部分有颜色变深发黑，或者很明显的细胞形态变化之类的，那种是出现分化了呢。

作者: yuhaoze 时间: 2013-12-26 22:03

这些细胞不是iPS吧，不像

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-27 08:26

回复孙帅帅的帖子9 v& x( T+ Z$ a; B; ?
1 U: Y- z& g r! K0 [0 k: M( \
把肾小球去掉就对了，是表皮里的黑素细胞，
我现在用的胰酶都是**%胰酶/EDTA,用EDTA消化有什么不一样的吗？:D

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-27 08:29

回复 yuri.2004 的帖子$ W5 s5 _  X& T+ g  I% c
6 Z$ ?/ p0 N% O. I) c
我这个是挑取的克隆，吹打的太厉害了，现在贴壁4天了，& y" O  M6 J  v  a
之前形成克隆的时候，边界就是这样的细胞，中间是克隆
样的，我这不会是一边克隆，一边分化把？请指教啊！- q0 Z; f, i# i2 S) v& }
1 t  w, Q8 h& e: ]/ _" @0 ?8 L( t
补充内容 (2013-12-27 08:31):
另外，那些克隆现在出现了中间变黑的现象，难道真像你所说的分化?

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-27 08:30

回复 yuhaoze 的帖子: u9 Z' C V) Y2 N# D3 y: o; g Z
) v0 T/ K% S1 ^2 d5 s2 Q3 O6 ^. m6 o
打击我了！会不会细胞来源不一样，生长形态就不一样，$ }1 P! m) ^, J
这种细胞我之前做过碱性磷酸酶染色，阳性。

作者: 穿裙子的猫 时间: 2013-12-27 08:33

回复 yuri.2004 的帖子8 v2 ]+ }0 s2 F" v3 ^
4 ]+ t# }" S2 c) G# W5 O. [
那你是用哪个浓度的胰酶消化呢？一般是0.05%还是0.25%？

作者: yuri.2004 时间: 2013-12-27 10:07

回复穿裙子的猫的帖子 C4 z( d. t3 s0 [! f* u+ _

你这个应该看不出来是不是分化，细胞太少了。不过也有可能性。检测的话，最好复合检测。比如做做OCT4 SSEA-4检测什么的，这样心里更有底。) J6 @: p) F. z5 M
中间的IPS细胞的形态和我们差不多的。我们用的是表皮成纤维细胞做的。酶的话是0.25%的。给你发了个资料书上的干细胞分化后的图，你看看吧~
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作者: 孙帅帅 时间: 2013-12-27 13:48

EDTA对细胞损害比较小，消化细胞比较温和，我们消化ES就是用的EDTA

作者: yuhaoze 时间: 2013-12-27 14:28

回复穿裙子的猫的帖子0 k% l* C8 G% f0 Z4 M

不会，ES不是这个样。

作者: 葱葱 时间: 2014-4-3 16:31

回复穿裙子的猫的帖子2 i5 V! m Y( w3 `6 F( o+ n

你的iPS养成了吗？这个图哪部分是？我也在养呢，只是要到了焦虫，郁闷呢。

作者: Tivah 时间: 2014-4-4 11:19

回复穿裙子的猫的帖子8 F9 h: K1 o6 \; }( ~8 L
) X. @% U# Q- `# m0 e' }4 @
我也觉得像是诱导过程中的iPS，普通OSKM感染后6天左右的样子。

作者: 922922922 时间: 2014-4-6 17:54

回复 yuri.2004 的帖子0 U1 M$ R7 U% r2 G/ Z, U; `
( L N6 p4 I/ T" x" i, r
请问如果是无滋养层培养，培养液的配方有什么不同吗？

作者: 922922922 时间: 2014-4-6 17:54

回复穿裙子的猫的帖子
3 @6 ?( c$ P3 w- P$ A# K2 h7 i+ I+ Q
貌似有些分化，边缘已经不清晰了。

作者: 922922922 时间: 2014-4-6 17:54

回复穿裙子的猫的帖子' y, S4 n8 {( U- y4 n
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貌似有些分化，边缘已经不清晰了。

作者: 葱葱 时间: 2014-4-8 16:28

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这像是iPS细胞。我像问一下你鉴定时，用的试剂盒吗？

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