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标题: 请高手指点这段话是什么意思？谢谢 [打印本页]

作者: lingli318 时间: 2014-1-6 10:40 标题: 请高手指点这段话是什么意思？谢谢

最近看文献，文献中这段话我看了几遍不知道什么意思，虽然自己之前是学生物的，对这方面接触的还比较少，想请高手帮我看下下面这段是讲什么的？什么意思，万分感谢！
The CMV promoter element was removed from the FLAG tagged tetrameric wild-type EosFP by restriction digest with BglII/KpnI and the annealed and phosphorylated oligos of the miniCMV promoter sequence (bp 51 to +77 of the CMV promoter) were inserted. This construct was then digested with ZraI to allow insertion of the annealed, phosphorylated and ligated HRE element oligonucleotides. Confirmation of HRE copy number was confirmed by digestion with KpnI/SspI/XbaI andthrough DNA sequencing by the Australian Genome Research Facility .

作者: tianzhang 时间: 2014-1-6 11:51

BglII/KpnI双酶切切除 FLAG标记的 tetrameric wild-type EosFP 中的CMV启动子元件。退火、磷酸化的miniCMV 启动子元件（就是CMV启动子的+51--+77片段）.

作者: tianzhang 时间: 2014-1-6 12:47

This construct was then digested with ZraI to allow insertion of the annealed, phosphorylated and ligated HRE element oligonucleotides. Confirmation of HRE copy number was confirmed by digestion with KpnI/SspI/XbaI andthrough DNA sequencing by the Australian Genome Research Facility .
上述载体构建完毕后使用内切酶 ZraI 消化酶切，然后酶连接 HRE 元件到上述载体上。通过 KpnI/SspI/XbaI酶切确认HRE的拷贝数， Australian Genome Research Facility进行DNA测序

作者: tianzhang 时间: 2014-1-6 13:03

大致意思就是：FLAG tagged tetrameric wild-type EosFP 载体经BglII/KpnI酶切去除CMV启动子，然后插入miniCMV启动子。载体再经过ZraI 酶切后插入HRE元件

作者: whs1230 时间: 2014-1-6 13:03

简单的说，这一段文章就是介绍了作者构建一个质粒的过程。关于其中一些元件的功能可能还得看上下文才能知道，这段文章的大姨就是：
用BglII/KpnI双酶切，切除FLAG 标记的野生型 EosFP（质粒还是啥？）上的CMV启动子（常用的真核启动子）。然后退火加了磷酸化修饰的miniCMV 启动子序列（(bp 51 to +77 of the CMV promoter) ），将这一段退火序列加入到原切除的地方。这一元件构建完成后，ZraI 酶切，引入退火的加了磷酸化修饰的HRE元件。最后通过 KpnI/SspI/XbaI酶切以及Australian Genome Research Facility公司的测序来确认HRE 的拷贝。
注：oligo退火知道是啥吧？从基因公司合成的序列退火形成一段双链DNA序列。3 N7 X" Z T, }/ I2 c' k
作者应该有带有酶切位点的所构建的东东的图谱，结合那个玩意看就会明白了应该。

作者: lingli318 时间: 2014-1-7 09:02

回复 whs1230 的帖子
: G. A! S+ i" `5 u6 o: u
谢谢，我大概知道什么意思了，请问这个实验过程是不是非常麻烦呢？

作者: lingli318 时间: 2014-1-7 09:02

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谢谢指点

作者: whs1230 时间: 2014-1-8 09:17

回复 lingli318 的帖子

不算麻烦，退火时可以直接把两条oligo丢到沸水里，然后关掉水浴锅电源使水温降到室温，也可以用PCR仪程序性降温，是单链核苷酸配对成dsDNA分子。大约1h。酶切酶连按照酶的说明书操作就可以了。酶切1-4小时，酶连过夜，然后转化感受态细胞做相关鉴定就可以。

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