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标题: 求助群友。。关于胚胎干细胞的核型分析，染色体纠结了。。 [打印本页]

作者: piaopiao 时间: 2014-1-31 22:36 标题: 求助群友。。关于胚胎干细胞的核型分析，染色体纠结了。。

本次实验步骤汇总：选取T12孔培养板其中的3孔细胞量入秋水仙素，终浓度为0.30μg/ml n/ q0 `3 D& Y/ j6 m+ K* _7 v
培养时间约为4h。0 ?" o5 C1 Z) t( r0 v
EDTA消化，吹下细胞约2ml，将细胞及溶液转移至15ml离心管，1100r/min 9min ; @/ K9 Y! D# \
加入已预温至37℃的0.075mol/L的KCl加柠檬酸钠低渗溶液10ml，充分混匀，置于37℃水浴锅约13min，中间时间段再用滴管轻轻吹散。
低渗完毕后，加入新鲜配置的固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）1-2ml，轻轻混匀，进行预固定。（时间约为3min）
1000rpm离心10min，弃上清，加入固定液10ml，轻轻吹打混匀，固定30min。
1000rpm离心10min，弃上清，加入固定液10ml，轻轻吹打混匀 20min
1500rpm离心，10min，弃上清。加入固定液2-3滴，约为0.2ml，轻轻吹打混匀成细胞悬液，滴片：将细胞悬液滴在冰水浸润洁净的载玻片（多聚赖氨酸免疫组化防脱粘附载玻片），长纤维纸迅速搽一下，50cm~60cm滴片，吹开，让液珠在载玻片上走一遍，空气晾干，3天前配（为原液）吉姆萨染色时间为10min，3min自来水冲洗，用吸水纸吸取表面大液珠，电吹风吹干，于200倍，400倍，1000倍油镜下镜检。

作者: piaopiao 时间: 2014-1-31 22:40

作者: piaopiao 时间: 2014-1-31 22:44

图也不知道怎么传。。简单描述下，液滴旁边有很多染色的碎片，然后游离的单个细胞，染色体分不开，而且，都看不出染色体的样子都，不知道哪里出错了。。单个游离的细胞我是2滴一个载玻片，约在30个左右，包括不合格的，观察到的染色体还是粉红的。。。还希望指教。

作者: 细胞海洋 时间: 2014-2-7 11:57

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作者: laner 时间: 2014-2-19 11:35

回复 piaopiao 的帖子% I% g$ ]1 [/ a( K F6 D" H/ r

低渗不足，染色体分不开

作者: Emma1986 时间: 2014-2-20 09:59

低渗那一步没做好，细胞膜没破，染色体出不来。低渗做好了之后，接着还要摸索秋水仙素的处理，祝你完成漂亮的片子。

作者: luyue6453 时间: 2014-2-20 16:30

回复 piaopiao 的帖子
# W) Y6 [9 A6 f y8 Y: `: P7 Y0 N
你加低渗液时，边加边搅拌，水浴20min。底片的时候倾斜45度角。离20cm距离感觉液体是摔上去的，自然分开，这样细胞才能分开，滴完以后，马上再火焰上烤一下，等液体都干了再染色，原液吉姆萨用pbs稀释，1:9。

作者: iseeyou1210 时间: 2014-3-22 01:41

lz低渗液时间太短。我一般是室温20min，其他的什么37度，什么45度角滴片，20cm摔片都是次要的。

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