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标题: 请问那位前辈用悬浮培养的方法富集过癌细胞系中的CSCs？ [打印本页]

作者: lamp0521 时间: 2014-3-4 16:06 标题: 请问那位前辈用悬浮培养的方法富集过癌细胞系中的CSCs？

如题，请问那位前辈用悬浮培养的方法富集过CSCs？具体方法是什么？效果怎么样？

作者: superlamp 时间: 2014-3-4 16:09

同问！

作者: maiweiqian 时间: 2014-3-4 21:57

同问，崩溃中

作者: tiramisu 时间: 2014-3-5 09:47

同问，最近也要用到这方面的知识

作者: zz091115 时间: 2014-3-6 12:14

细胞系很好养 DMEM/F12 基础培养基 2%B27 20ng/ml EGF 10ng/ml FGF2 可以对付大多数细胞系如果有些特殊细胞系再加点insulin就足够了胃癌类的细胞系貌似有点小特殊暂时不透露了再细致的童鞋可以加1% glutamax 和HEPES缓冲液维持PH 加点glucose也可以培养板用超低吸附的 corning有六孔板每孔种个几千细胞就够了别多了多了最后球体就太多粘在一起了每周换液两到三次球体长到200um就足够传代了

作者: maiweiqian 时间: 2014-3-6 23:36

本帖最后由细胞海洋于 2014-3-7 13:21 编辑 & A. r* [0 e4 T* i
9 u9 Z \2 }3 C l$ ]0 ]
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" ~! t2 v8 K% Y5 @4 i
想问您用的细胞系是？我就是用您说的这种方法提取细胞系的肿瘤干细胞，我每个六孔板的孔种10000个，我出现的问题就是您所说的，球体都粘在一起了。而且我的疑问是，那些球体到底是自发形成的还是我们当初种下去的细胞由于不规则运动而自发粘在一起的？我觉得似乎是后者。我种下去的细胞貌似没有增殖现象出现呢，很苦恼，您是离心换液？是怎么传代的呢？我的传代之后貌似就不活了，哎，各种麻烦。能和您交流一下么？

作者: zz091115 时间: 2014-3-7 01:09

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* o7 B7 U! x+ h& w' E
H460 A549 HCC827 MCF7 MB231 SUM159 MGC803我都做过除了MCF7长得难看点别的都非常圆我做过单细胞成球实验可以成球一般细胞系一周成球差不多了换液离心就可以了传代的话加胰酶一到两分钟消化为单细胞重新接种会再次成球一个孔一万个细胞太多了

作者: maiweiqian 时间: 2014-3-7 09:40

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看来是我种得太多了，我试试降低密度。你的细胞球会不会粘在一起啊？我试过吹散粘在一起的细胞，貌似不过多久，他们又再聚集在一起？单细胞成球的实验，我是打算稀释很多倍之后在96孔低吸附板上面做，您有没有什么好方法？问得有点多了，实在打扰您了。

作者: zz091115 时间: 2014-3-7 11:29

回复 maiweiqian 的帖子2 |- }7 a |4 X3 a) Y" s( L5 e

降低种植密度试试2000个梯度稀释可以也可以直接用流式单孔分选

作者: maiweiqian 时间: 2014-3-7 13:08

回复 zz091115 的帖子6 m8 R; ]- ~( H, l% m: @) ^6 J

嗯嗯，我试试看，谢谢您啊

作者: zz091115 时间: 2014-3-7 17:08

不客气祝实验顺利

作者: zz091115 时间: 2014-3-7 17:09

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' g' Y" i! M! z, g2 q$ y6 I
不客气祝实验顺利

作者: superlamp 时间: 2014-3-13 13:17

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+ c0 w; X1 D% P, p0 p
超低吸附的有些贵啊，用普通的悬浮培养六孔板可以吗？还有就是如果用超低吸附的，细胞系中一些非干细胞会因为不贴壁而很快死掉还是需要一段时间？

作者: superlamp 时间: 2014-3-13 15:18

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+ C/ Z G' M2 `1 m: \7 b0 _" h! Q
非干细胞的bulk cell在3D培养中会成球吗？

作者: zz091115 时间: 2014-3-17 13:17

回复 superlamp 的帖子
! ]% \* W6 n5 F
普通板子会贴壁 bulkcell不会成球分化细胞会过两三天消失

作者: 学养干细胞 时间: 2014-4-23 19:49

回复 zz091115 的帖子# W" [, y: ?( k1 {9 t$ X( o
; h2 ^; N! b6 [( i* w
因为我想流式分选细胞球，就要求细胞数目，用的是10cm的皿，现在的细胞数目是10^6级，出现了很多抱团的珊瑚状的东西，估计就是仁兄说的密度太大的原因。不知道你用过10cm的皿吗，建议多少细胞呢？

作者: zz091115 时间: 2014-4-24 10:15

回复学养干细胞的帖子
" F2 f& g, Q6 W* z; K/ p' Z
六孔板我不超过5000 10cm的dish你自己按照面积估计

作者: 青云之上 时间: 2014-4-24 10:54

回复 zz091115 的帖子$ ]. k% t, w6 A) \! h; [) c" f
) _! k8 A* p6 y. y3 K9 O3 \
我们一直是直接从肿瘤组织分离单细胞，做悬浮培养，刚开始原代克隆球很多，但是增值很慢，一传代克隆球就越来越少，不知道您用这种悬浮富集的方法，增值传代情况如何，还请指点~~

作者: zz091115 时间: 2014-4-24 16:02

回复青云之上的帖子
) ]6 b6 r0 f+ o+ b
哪种肿瘤原代

作者: 青云之上 时间: 2014-4-25 09:09

回复 zz091115 的帖子2 V, o0 e3 \( @5 i

乳腺和肺癌~~

作者: zz091115 时间: 2014-4-28 10:19

回复青云之上的帖子0 b- K" Q* e% M

这个我们可以传代扩增但是现在不方便透露抱歉发了文章再告诉你吧

作者: 青云之上 时间: 2014-4-28 10:29

回复 zz091115 的帖子
" W- \" ]3 {- V, `' p
什么时候发文章？发了记得说一声~~~

作者: zz091115 时间: 2014-4-28 21:21

回复青云之上的帖子

争取三个月内投出去然后就祈祷一下呵呵发了我就传上来如果斑竹不嫌弃的话

作者: 青云之上 时间: 2014-4-29 14:20

回复 zz091115 的帖子, d% l" }8 _3 `7 {6 A
# f/ R! g5 y' m" j9 |9 S- l
那必须，这个问题总得有人解决么~~~

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-5-27 10:43

回复 zz091115 的帖子
! |8 o/ B4 f, q, F/ R: E- \9 a2 z; }
请问你做过A549吗？

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-5-27 10:44

回复 maiweiqian 的帖子7 n# C0 g1 Y# _8 F' ]
' k$ D; K4 h/ ~0 w- p4 Z
请问你做过A549的成球实验吗？我做的每个孔10000个细胞，但是还是有很多细胞聚团，请教一下这个可能是什么原因？

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-5-27 10:45

回复 zz091115 的帖子5 e) n; q$ b' J% g% h( }

请问你做过A549的成球实验吗？我做的每个孔10000个细胞，但是还是有很多细胞聚团，请教一下这个可能是什么原因？

作者: 细胞海洋 时间: 2014-5-28 09:09

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- z$ @ M6 C L6 y. e! V3 R
建议你发新帖提问

作者: zz091115 时间: 2014-5-30 20:54

回复 KINGxuridongshe 的帖子6 o. u- j, R- K& ?6 }% c
: }, R, C4 L1 H
初始密度太大 2000差不多了这个细胞sphere本身形态也不好看

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-5-30 22:35

回复 zz091115 的帖子! S9 ~& s# f) Q' t# R
5 p: Q1 E4 S6 d
请问你做过A549 sphere吗？

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-5-30 22:36

回复 zz091115 的帖子 N( |; E: u, i5 ~
- x0 V) O% t! L6 |) g' c1 K
2000 是不是有点少，六孔板

作者: kakapo 时间: 2014-6-1 21:30

for non-adherent cell, you can directly culture it in suspending
for adherent cell, you firstly make cells pellet. you do not disperse the cells pellet and directly culture the pellet. the cells will form cells clustered spheroid: ?6 m+ ]- d' B% `2 L
the spheroid size depend on original cell number. Your question is not that clear. please, post your question in detail.

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-6-1 22:02

回复 zz091115 的帖子
! _2 C5 D J4 W
你好，能把你做的A549 tumor sphere图片给我看看吗？我最近在做这个但是不是很理想，有些问题如果你方便能请教一下吗？

作者: kakapo 时间: 2014-6-3 14:55

sorry, I do not have lung cancer cell line in hand. Well, the cell cycle length of A549 cell is approximately 36 hours, and is longer than other tumor cell line. time for forming sphenoid of A549 will be longer.
3 q9 v% L& f; @6 c; T& ~
to make cell sphere, if i did the work, I am going (1) to pellet 50000 cells in tip of eppendorf. Next, I will (2) discard PBS ( in last wash), (3) gently add 100 micro-liter FBS. (4) keep cells in eppendorf until pellet is floating. (5) transfer pellet to the 96 well plate.

作者: zz091115 时间: 2014-6-5 10:09

回复 KINGxuridongshe 的帖子 ^; w4 z* o; X) `" q+ F
# _ L( j8 M# B1 F2 T9 m
做过

作者: zz091115 时间: 2014-6-5 10:09

回复 KINGxuridongshe 的帖子, @. Y& X' z U6 ?3 c! ]+ b, J" X
& g& R/ g9 @& @* g/ P9 a6 j
不少够了

作者: zz091115 时间: 2014-6-5 10:11

回复 KINGxuridongshe 的帖子8 v2 X0 l( e, U: O. J8 Q5 U
4 m* \7 E( q& @5 [& h
没有我主做原代只是拿这个细胞养过看了一下

作者: KINGxuridongshe 时间: 2014-6-19 14:22

回复 zz091115 的帖子$ f {2 v1 J8 A9 w

你好，看你的帖子对于干细胞悬浮球培养有很深的了解，我现在的课题和肺癌干细胞相关，但是现在在实验过程中用A549成球一直不理想，和文章中悬浮球的样子和培养的时间都有出入，所以想请教一下，希望你能在百忙之中指点一二，

作者: 细胞海洋 时间: 2014-6-20 08:29

回复 KINGxuridongshe 的帖子
2 w' {+ f" t% K5 r
发一个新主题把你的问题详细说明我给你加高亮

作者: zz091115 时间: 2014-6-20 16:30

回复 KINGxuridongshe 的帖子& M+ t/ q- | B5 E7 L

版主让你开个新帖子然后你详细说明我再回答你吧

作者: wangxudong555 时间: 2014-7-2 19:49

回复细胞海洋的帖子1 |0 `6 O1 d0 c; n/ M+ p3 v
8 O ~( B1 S1 J& Y
怎么把我发的新帖给删掉了？

作者: wangxudong555 时间: 2014-7-2 19:49

回复 zz091115 的帖子$ \0 q. t3 P& u; L% x4 x& C. c

我开了新帖，但是被版主给删掉了，什么情况

作者: 细胞海洋 时间: 2014-7-3 11:39

回复 wangxudong555 的帖子8 ]9 u, C6 n: L7 K" ?2 z

没有删除记录你确定发帖成功？

作者: hottodeath 时间: 2015-1-24 16:59

本帖最后由细胞海洋于 2015-1-25 23:14 编辑 / f) g6 T( _4 H/ z0 g
8 J* w" e4 H$ R' [
回复 zz091115 的帖子3 h" @1 e" t$ H

我要从MCF-7中富集肿瘤干细胞，周围没有做这个的前辈，

作者: 细胞海洋 时间: 2015-1-25 23:15

回复 hottodeath 的帖子, o* P: a" a. ?
7 x% `- [ J7 b% }3 Y0 x( _
建议你直接发新帖说明问题

作者: hottodeath 时间: 2015-1-26 10:46

本帖最后由 hottodeath 于 2015-1-26 10:46 编辑 % X" z9 q1 M4 ^, j8 H2 b
7 e: B! N" k$ M

好，谢谢

作者: scarletkiki 时间: 2015-3-18 09:50

种植密度不要太大，一般500-1000/25cm2

作者: hottodeath 时间: 2015-4-16 12:35

回复 zz091115 的帖子

你好，我MB231似乎是养出球了，但MCF-7还是不行，而且似乎231换成无血清培养死掉的比例并不多，是因为有干细胞特性的在231里面占的比例本来就比较多的缘故吗？

作者: zz091115 时间: 2015-4-16 18:09

回复 hottodeath 的帖子6 E5 ^! {# |$ w7 n: G
$ K1 R' u3 S6 y7 Y; k
MCF7的sphere形态不典型需要添加insulin

作者: hottodeath 时间: 2015-4-16 19:57

回复 zz091115 的帖子, u# X4 E7 S( k q8 I
5 e) ^3 n! C( @* U& R) o+ p
我加了5μg/mL的胰岛素也还是没养出来

作者: zz091115 时间: 2015-4-22 10:38

回复 hottodeath 的帖子* J8 E A- |: G$ X! Y9 m4 S! _1 ^$ e
; U8 ^4 W- {' ^
再加点地塞米松试试

作者: hottodeath 时间: 2015-4-27 09:29

回复 zz091115 的帖子" \) _* L0 o% S2 U

好的，谢前辈指教！

作者: hottodeath 时间: 2015-4-27 09:31

回复 hottodeath 的帖子
; F& n2 W9 X' j1 Y9 G, `* A" X! S
能否再请教一下前辈：加地塞米松的功效和加的量呢

作者: zz091115 时间: 2015-4-27 18:55

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具体效应记不住了好像也是哪里看来的参照诱导3T3L1那个剂量试试

作者: hottodeath 时间: 2015-4-28 09:18

回复 zz091115 的帖子' s, q2 ]! M/ \4 Q$ P1 l( {" `/ b

谢谢前辈！

作者: lily132 时间: 2016-7-15 09:38

回复 zz091115 的帖子

你好zz091115 V9 u! S# |: \1 m9 U! h
请问你怎么知道细胞长到200um了呢？如何测量的呢？

作者: lily132 时间: 2016-7-15 09:40

回复 maiweiqian 的帖子8 n& q: ?+ u9 M* Q5 Y9 e" t

我也遇到同样的问题，你的问题解决了吗？现在传代后细胞怎么样了？

作者: lily132 时间: 2016-7-15 09:41

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. m1 h r9 H/ {+ {
你好，请问你做过U251细胞没呢？我做了好多次，每次消化后细胞就死了

作者: 细胞海洋 时间: 2016-7-15 10:17

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作者: lily132 时间: 2016-7-15 10:22

回复细胞海洋的帖子

好的，谢谢

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