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标题: 人胚胎干细胞求助 [打印本页]

作者: CD603572813 时间: 2014-3-9 18:00 标题: 人胚胎干细胞求助

各位大侠：最近刚开始学着养人胚胎干细胞x-01!可是这个细胞貌似很矫情啊，养着养着就分化了，在此向给位求教，一般采取什么措施可以减少细胞细胞分化啊？或者各位有何经验之谈？谢谢各位了

作者: 老十 时间: 2014-3-9 18:58

个人觉得，人的干细胞的培养要每天换液，操作要规范，看到有分化的要及时处理。

作者: CD603572813 时间: 2014-3-9 19:13

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这个分化了的要怎么处理呢？我是用培养瓶养的

作者: 老十 时间: 2014-3-9 20:10

刮掉吧

作者: nichifanlema2 时间: 2014-3-10 08:43

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摸索最适的饲养层密度，饲养层细胞的密度很重要。人的ES一般用CF-1品系小鼠失活的MEF作为饲养层。ES的密度也不要过于密集。

作者: ciweiyuan 时间: 2014-3-10 09:33

1.饲养层密度2.5x104/cm2$ {$ Z8 W1 L% s0 a: K1 r
2.用cf1品系, {: c) z) h" H& u6 A7 h
3.ips不要养太密
4.每天必须换液

作者: Jonathan 时间: 2014-3-10 10:50

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你这个feeder的密度太高了吧?

作者: CD603572813 时间: 2014-3-10 11:08

回复 nichifanlema2 的帖子3 X9 ]. g" u) [" O9 X
?8 r' D; ]$ {1 Q X
您BFGF的浓度一般用到多少呢？我买的是10微克一只的

作者: CD603572813 时间: 2014-3-10 11:12

回复 ciweiyuan 的帖子) L6 z7 ?% F& @
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我现在遇到了两个问题：一、已经分化了的细胞我还不知道该怎么处理掉，之前有人建议说挂掉，可我是养在培养瓶里面的，所以这个操作对我来说有点难，不知道您是怎么处理分化的细胞的？二、已经长大的克隆，您是怎么处理使其变小的？我用的是枪头吹打的，这样一来会产生很多起泡影响吹打的效果，同时这样吹打貌似对细胞的损伤也会比较大，不知道这个问题您是怎么处理的？谢谢啦

作者: CD603572813 时间: 2014-3-10 11:13

回复 Jonathan 的帖子$ v: W' z; J8 P. B

那您建议用什么密度更好一点呢？

作者: Jonathan 时间: 2014-3-10 12:43

回复 CD603572813 的帖子8 J0 [0 R# Z( ], t7 s# H! V
% I4 I6 R- } B1 g e, w4 T
我在老裴那里，1.5M是for一个plate，通常是一个6-well plate

作者: hustdreamer 时间: 2014-3-10 13:20

回复 CD603572813 的帖子' P6 U$ _, D; q; i

显微镜下找到分化的地方，用mark笔画上圈圈，用吸泵将分化的地方吸走；用枪吹打传代没什么问题。

作者: ciweiyuan 时间: 2014-3-10 13:26

建议酶消化的时间控制好，这样吹打后的效果好

作者: nichifanlema2 时间: 2014-3-11 09:27

回复 CD603572813 的帖子: r! h; a. a* \, z* N

4ng/L

作者: plainxie192 时间: 2014-3-11 09:36

我们也是用的上面提到的feeder密度，养在培养瓶确实不好传代，建议你改用培养皿，这样就可以在体式镜下区分分化的细胞，传代时先用tip划出格子，再轻吹打起来，不会有泡泡的，注意力度。

作者: shaozi402 时间: 2014-3-11 09:46

回复 CD603572813 的帖子8 f) m7 w7 s+ W% p" z) _ R6 ~
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我们的H1，80%的时候传代比较合适，再密一些可能就会有部分分化

作者: wuxiao101325 时间: 2014-3-11 09:51

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关于feeder密度问题，这个主观性比较大，个人感觉传代时密度为85~90%为宜，复苏则再密一点，还是自己摸索适合自己的最佳条件最好；我们养ES一般用6cm皿，预coating geltin0.1%，方便操作，也不浪费培养基，除非需要扩大才换10cm皿；每天挑分化换液，我们是用200微升tip把分化克隆刮掉，这里的分化也很主观，我个人比较完美主义，只要是看到不像未分化的ES克隆的统统挑掉，换液时自然就去掉了；传代我们还是用tip锋利的边缘分割小，按自己能做到的程度尽量分割小，分割法按井字形分割即可，最后刮起来直接传代，这样传出来的ES克隆就可以保证大部分大小是均一的，如果开始不能割小，可以考虑转入15ml离心管，用1ml移液器吹打1~2次，切记不可过分吹打！！！

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