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求教：脐带间充质干细胞胶原酶消化后有大量细胞但养不活怎么办
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作者:
edwardellen
时间:
2014-3-17 17:52
标题:
求教：脐带间充质干细胞胶原酶消化后有大量细胞但养不活怎么办
做脐带间充质干细胞分离，脐带去除血管和羊膜，剪碎至小块，用同等体积的1mg/mL的Ⅳ型胶原酶消化2.5-3小时，加30%体积的血清终止，之后用PBS稀释4倍后离心，2000转10分钟，弃掉一半上清，继续用PBS稀释，重复离心，一共洗4次，可以收获很多细胞，大小上看应该是间充质干细胞，肯定不是血细胞，用10%血清的DMEM/F12培养基培养，血清是德国的，细胞第二天贴壁少，几天后很多死亡，只能残留很少一部分，形态也不太好看。这是什么原因，求赐教。
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另，大家是如何去除红细胞的？每次我拿到的脐带动脉里总是有血，红细胞很多，要换两次液才能去除干净，红细胞存在对间充质干细胞生长是否有影响？
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多谢多谢！
作者:
伊诺强
时间:
2014-3-18 08:28
去除红细胞的方法，一般是将脐带剪成2到3CM小段，用镊子挤出淤血，用生理盐水洗净，一般情况会残留很少的！再取出血管和外皮。另外血细胞多肯定影响贴壁和生长！血细胞密度（质量）大、数量多，占据大部分培养皿的表面，自然MSC没有机会贴壁！个人看法，仅供参考！
作者:
edwardellen
时间:
2014-3-18 10:42
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伊诺强
的帖子
- C3 u$ m! A( z3 B
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之前我没有清理血就直接去血管，下次我试试先把血清理干净，谢谢！
作者:
月_幻影
时间:
2014-3-18 11:17
我们一般是拿到脐带后首先用加双抗的盐水将外表的血污洗净，并用镊子挤压出血管内的部分残血，然后剪成小段后再次清洗，并尽量将残血挤净，最后除去羊膜和血管；另外LZ的细胞死亡是不是跟转速有关系？感觉转速有点高啊、、
作者:
edwardellen
时间:
2014-3-18 14:47
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月_幻影
的帖子
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- q% y y9 f0 ?9 ?: |
谢谢！还想请问一下，您做的时候转速是多少啊？我以前做过1000，但是感觉细胞有点下不来，可能是就是胶原酶消化以后的液体特别黏。我看有人用透明质酸酶再次消化的，请问您试过么？
作者:
flylover1221
时间:
2014-3-18 16:57
已经有人说了，红细胞尽量去除干净，还有就是消化完以后我们会过筛网，滤去未消化的组织，离心是1300rap,6min，4℃，希望对你有所帮助。
作者:
azzyou
时间:
2014-3-18 17:19
先用酒精洗一下，用生理盐水洗个三次，能洗掉很多血，剩下的换液就可以换掉了。
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作者:
a352167963
时间:
2014-3-18 17:23
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edwardellen
的帖子
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建议你缩短消化的时间大概40分钟左右试试吧
作者:
a352167963
时间:
2014-3-18 17:24
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edwardellen
的帖子
" s+ e! W1 h8 D4 u ~- d. O0 a+ E
: y+ f2 [, H( G" k8 k! n
37度40分钟左右就可以了
作者:
edwardellen
时间:
2014-3-18 21:32
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flylover1221
的帖子
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, V& l, U9 ]7 z! E6 V/ A7 t
谢谢，请问你们过的是哪种滤网？我这有铜网，可以么？
作者:
edwardellen
时间:
2014-3-18 21:33
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a352167963
的帖子
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谢谢！
`# l9 j% @8 S2 y0 l8 o' m
请问您用的是哪种胶原酶？我用的是sigma的 Ⅳ型胶原酶。
作者:
flylover1221
时间:
2014-3-19 11:04
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edwardellen
的帖子
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) q$ `5 o6 K+ S1 s+ Y& t. Y
我们用的是80目的不锈钢滤网，铜的应该也可以吧，只要做好清洁和灭菌消毒一样吧。
作者:
月_幻影
时间:
2014-3-19 13:09
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edwardellen
的帖子
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我没用过透明质酸的方法，我们这边都是用组织块法来养细胞的，酶消化法在大学的时候做过，转速是1000多，具体多少记不起了
，不过你消化完后可以过一下筛网去除一下组织小块和红细胞，另外就是细胞的生长状态跟母体是脱不了关系的，每个人的体质是有差异的，不排除这种因素导致的细胞死亡，我这边曾经做过一根脐带，刚爬出细胞P1代就老化死亡了。。。
作者:
米东
时间:
2014-3-19 13:23
生理盐水洗出血，两性霉素和双抗洗，再生理盐水洗，这样去血，去血管，这样能得到灭菌干净华氏通胶了。不要一开始就消化酶处理，你要等脐带间充质从肉糜组织里面长出来再处理。还有终止用临床培养基，不要带血清的，研发可以
作者:
cqstemcell
时间:
2014-3-19 13:57
同意楼上的，先用酒精洗一次，再用生理盐水洗3次，尽量把镊子把血管里的血挤出来，不要有残留。不贴壁的话，可以考虑提高血清的浓度或者考虑是否有污染的问题，仅供参考
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，不过你消化完后可以过一下筛网去除一下组织小块和红细胞，另外就是细胞的生长状态跟母体是脱不了关系的，每个人的体质是有差异的，不排除这种因素导致的细胞死亡，我这边曾经做过一根脐带，刚爬出细胞P1代就老化死亡了。。。