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标题: 2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感 [打印本页]

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-28 20:37 标题: 2014年 Nature scientific reports上的一篇关于“重组蛋白诱导iPSCs”的读后感

自己一直在做蛋白诱导猪iPSCs的工作，最近看了一篇相关方面的文献，在这里与大家分享下！同时也有以下疑问想下大家请教下，欢迎拍砖！！！
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题目：Partial Somatic to Stem Cell Transformations Induced By Cell-Permeable Reprogramming Factors  杂志：Nature 下面的SCIENTFI REPORTS , IF 不高，但文章质量还不错，如十几年前 cell 下面的 stem cell，文章作者为KIM，参考文献中有他的三篇一作SCI论文，推测可能是做蛋白生产、生物治疗和疾病机制等方面工作；这篇文章应该是其第一篇蛋白诱导重编程的文章。文章的工作量还是不小的，且只有四个作者，还要除去一个通讯作者，文章详见附件！！！ ( Q& h1 v5 P" A4 P

一. 文章的结构：( I; q( d; b" a$ J: a
1. 蛋白的制备分为A、B两组：0 G4 j. v3 g& z  \" X5 a
A组: Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc和Nanog（OSKMN）的编码区亚克隆至Pet28a载体中，同时加上MTD（使重组蛋白入核）, HIS-TAG（利于纯化）, NLS（核定位序列）等序列，获得重组蛋白；  可能由于A组没有针对表达菌株为大肠杆菌进行密码子优化，OSKMN的表达量不高，且是包涵体表达；在此基础上，想获得更多和可溶性的重组蛋白，于是有了B组。+ R0 b7 h& ^6 P8 e
B组: ，对OSKML进行了基因优化，同时根据蛋白的表达量和可溶性表达筛选了不同的MTD, 但遗憾地是，好像文章后续诱导所用的蛋白为变性条件下的蛋白。% R3 f: p1 B; D
3 ?! s0 h7 C" ?9 s/ v! J% G! H. s
2. A组重组蛋白介导的重编程（hES培养体系）：有两种方法：A组：诱导全过程中添加蛋白；B组：间断添加蛋白
考虑A组蛋白在与细胞共培养时有析出现象，且Nanog溶解度最低，于是考虑使用B组蛋白介导重编程。; R$ n% G3 \6 I' {. _8 t. c

3. B组重组蛋白介导的重编程（偏重于mES培养体系）：也有两中种方法：A组：无Vc 加Lif 诱导，B组：有Vc 加Lif 诱导 --- 能形成很好的对比
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二. 总结
1. 文章结构紧凑，一环套一环，能相互对比，也能在各组别之间对比，这样讨论的东西就比较多，同时文章的图片拍摄和排版也很好。这暗示我们做实验室时就要想好文章的整体思路
2. 文章写的比较诚恳，不夸大，不浮躁，如只得到了部分重编程的干细胞，得到的干细胞克隆不能增殖传代。这些都是值得我们借鉴和学习的
3. 文章讨论部分： A. 提到了蛋白在细胞培养基中的溶解度问题，这是以前文章中没有提到的;  B. 还提到了加入蛋白三天后，就出现了克隆，他们感觉与其他重编程相比，这个出克隆的时间太快了，不利于细胞的充分重编程，就如一个人跑的太快了容易摔倒，这暗示我们应该降低这个过程，如降低蛋白的浓度，改变因子加入的顺序（c-myc蛋白可能会加速细胞的凋亡）。

三. 疑问
1. 本文中是根据什么确定使用何种MTD的，这些MTD与以前的TAT,9R，11R 又有何种优势？？？自己不是很了解，请高手指点
2. 文中对纯化后的蛋白纯度和检测没有说明，文章中只有一张SDS-PAGE图片，并且没有WB图片，虽说做了荧光素酶试验说明了其转录活性
3. 为什么这些AP阳性、表达某些多能性基因的克隆不能增殖呢，这与2012年张慧的文章结果是相似的，他们用重组蛋白介导iPSCs也没有建立稳定的细胞系  对于这一问题大家怎么看？？？/ @- G- X9 p. s6 L6 p. P
4. 我最近也在做原核表达OSKMNL这两种蛋白，然后介导猪的体细胞重编程！！！   这方面的工作现在也比较多了，套路都差不多，大家能帮我想想还有什么地方，还可以做哪些创新，以便于将来发好文章。 1 N0 F6 s' s# {' z
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欢迎讨论，自己也额外上传了最近5年的几篇蛋白介导重编程的经典文章！！！& ?0 a* t8 O- }9 K) S( t6 p
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补充内容 (2014-3-29 22:10):
关于蛋白质介导体细胞重编程:7 [! |: C+ D% C: F4 Z* f  _
1. 蛋白的可溶性与否，这直接关系到蛋白的质量和制取的工作量及成本；6 Y8 q7 Z1 L& [$ O0 h$ P1 a
2. 蛋白质在细胞培养基中的溶解度，如蛋白与细胞共孵育一段时间后，蛋白析出的问题！: |! n7 d8 `7 T% k# Q

补充内容 (2014-3-29 22:16):0 W+ N9 Q4 _) l0 p5 O, r
3. 蛋白添加的顺序也应该优化，最近裴端卿组有一篇iPSCs诱导过程中EMT-MET的文章（2013.10,月份记不清了），其中c-MYc添加的顺序就是在中间添加的，如果蛋白介导iPSCs也按这样的顺序，是否会出现能增值的克隆呢？？
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: N! z; H) _( o  U) }: ?
补充内容 (2014-4-6 14:55):
感谢Xray19 上传的一篇关于“ 重组蛋白维持鸡ESCs多能性”的文章，文章发表在SCIENCE CHINA Life Sciences 上（2013年见刊），有中国农业大学的Ying完成，技术是实验室的常规技术，但文章的起点不错，有创新性！

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-28 20:39

[attach]60264[/attach]

作者: Damon-Salvatore 时间: 2014-3-29 08:43

我有一个老师10年发了篇用TAT引导OSMK进入细胞进行重编程的文章，但是由于重组蛋白进入细胞后，滞留在内含体内，效果并不是太好。原文如下：
[attach]60266[/attach]

补充内容 (2014-3-29 08:45):4 R" g# v% _4 Q1 j: l
剩余的希望大家多多指点

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-29 10:16

回复 Damon-Salvatore 的帖子1 o) i1 `2 j0 Y k

这篇文章看过了，你现在还在西北农林嘛？

作者: Damon-Salvatore 时间: 2014-3-29 10:57

回复 Andyhigh 的帖子

嗯现在大三。前辈现在在什么单位呢？

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-29 11:22

回复 Damon-Salvatore 的帖子5 z C' r3 b# f

在安农大读研究生，你也算是个牛人啊，我大三都不知道在干啥呢！

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-29 11:25

回复 Damon-Salvatore 的帖子! S) k/ m3 V+ X
6 _% [2 m* }( F' T+ B
第34届国际动物遗传学大会今年七月底在西安举办，这个会议你可以关注下
链接：http://www.isag2014.com/plus/list.php?tid=29

作者: Damon-Salvatore 时间: 2014-3-29 13:57

回复 Andyhigh 的帖子
" A8 H) k3 r$ k4 u
恩谢谢前辈。这种会议是在什么地方找到的呢？亏我还在西安附近，这些都不知道。是在科学网还是？

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-29 22:06

回复 Damon-Salvatore 的帖子 |) d% u/ f) S1 |

是去年在成都开会，李宁院士在会上把这个会做了一个广告，之后就一直留意了下，07年诺比尔奖得主 Mario Capecchi 教授也出席这个会议；这些东西是朋友多了，圈子大了，也就知道了！

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-29 22:27

关于EMT-MET的文章：[attach]60275[/attach][attach]60274[/attach]

作者: Damon-Salvatore 时间: 2014-3-30 07:53

回复 Andyhigh 的帖子# g( [; e0 Y" r) v
4 S* H8 I3 U) \$ u2 v- ^
恩恩受教

作者: Damon-Salvatore 时间: 2014-3-30 08:30

本帖最后由细胞海洋于 2014-3-31 10:13 编辑
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回复 Andyhigh 的帖子9 R# q" n7 H3 A$ _9 z

简单看了一下，没有特别感兴趣的。唉，承办单位有我们学校，注册费应该照顾一下本校学生么，今天提前注册截止，学生1300RMB。我计划研究生阶段做器官移植相关的研究，希望能到匹兹堡大学，比较难申请的感觉

作者: suxiaomei 时间: 2014-3-31 11:08

回复 Damon-Salvatore 的帖子6 p) S* X3 J8 g7 b- q' b
3 K9 ?4 N; }: B t* Q+ r# g. I. J
哈哈厉害啊同为西农人

作者: zhangweihwz 时间: 2014-3-31 12:58

现在无论什么方法拿到iPSCs已经不是巨大问题了。iPSCs质量变得尤为关键。现在目前可以提高iPSCs的质量的报道还是比较有限。5 C, ^/ E# ^; a# C) A" M
除了Tbx3、Zscan4，还期待有更多的因子或者诱导方法可以提高iPSCs的质量。

作者: Andyhigh 时间: 2014-3-31 16:29

zhangweihwz 发表于 2014-3-31 12:58 + l- K$ o" Z7 k3 ?, A) K
现在无论什么方法拿到iPSCs已经不是巨大问题了。iPSCs质量变得尤为关键。现在目前可以提高iPSCs的质量的报道 ...

想请教下 iPSCs的质量是如何判定的，除了能产生嵌合体后代或具有生殖系传递功能等大指标外，有哪些量化的具体指标呢？我看着的文章一般都做了AP检测、生长曲线，多能性基因和体细胞特异性基因的荧光定量RCR，多能性基因的免疫荧光染色，干细胞的拟胚体和畸胎瘤实验2 [8 L6 S" K/ L, k# m7 @
" r2 R& U4 j5 W- G+ d# W
此外还有免疫原性，四倍体补偿获得可存活的健康后代，那么iPSCs的质量还有哪些值得考虑的呢?

作者: zhangweihwz 时间: 2014-3-31 17:14

AP染色等等只是检验细胞是否为多能性细胞的一般方法。
产生具有生殖系嵌合的动物以及通过四倍体补偿技术获得完整动物才是检验iPSCs质量重要方法。
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补充内容 (2014-3-31 17:17):, p( g3 k( S5 ?9 l" I6 w: A
高绍荣等发现发现了一个印迹基因Zrsr1，该基因的低甲基化导致了iPS细胞系完全多能性的丧失。Zrsr1基因的甲基化程度的高低，可以作为判定iPS细胞系质量的标准之一。

作者: Andyhigh 时间: 2014-4-1 08:18

zhangweihwz 发表于 2014-3-31 17:14
9 s& R& D, a6 x4 Y S3 ?8 \# qAP染色等等只是检验细胞是否为多能性细胞的一般方法。+ N K8 h v2 N/ O) W1 l
产生具有生殖系嵌合的动物以及通过四倍体补偿技术获 ...

能提供下Zrsr1 的这篇文章嘛？？？

作者: zhouhuaxizhu 时间: 2014-4-1 10:31

长见识了，各位都是重编程的高手，尤其是在蛋白方面。学习了。

作者: thinktank 时间: 2014-4-1 11:12

你是WF？

作者: wanglimaomao 时间: 2014-4-1 17:02

我对蛋白重编程不是很了解。但是针对不能扩增传代有点想法。也不一定正确，欢迎批评指正。首先体外合成的蛋白对于细胞内自身合成的蛋白还是有一定区别的。进入细胞内发挥一点作用后，还是会被细胞的酶类等自身消化。而基因转染，是把特定基因整合到基因组内，这些蛋白可以持续表达，即使被降解了，还是会继续产生，所有能够保持干性，传代也不会受影响。而蛋白转染，一旦细胞传代，总量就会显著减少，无法维持干性。

作者: xray19 时间: 2014-4-5 23:01

wanglimaomao 发表于 2014-4-1 17:02 7 W+ f8 _5 U; A, c& B! @2 Q
我对蛋白重编程不是很了解。但是针对不能扩增传代有点想法。也不一定正确，欢迎批评指正。首先体外合成的蛋 ...

即便将4个基因整合到基因组中，当细胞向ipsc转化过程中，外源表达的基因会逐渐被沉默的，直至最后完全沉默。与此同时，细胞内源性的干性基因会逐渐获得表达。

作者: xray19 时间: 2014-4-5 23:06

感谢楼主，我也提供一篇protein transduction induced ipsc 的文章，供大家讨论

作者: Andyhigh 时间: 2014-4-6 07:05

xray19 发表于 2014-4-5 23:06 % T5 J, w. }0 e! N- k+ ~
感谢楼主，我也提供一篇protein transduction induced ipsc 的文章，供大家讨论

# h" ]1 e( s& Z2 R# Z# [# W. w
最好上传下文章！！！

作者: xray19 时间: 2014-4-6 11:56

[attach]60473[/attach]
不好意思，昨天没上传上去

作者: Andyhigh 时间: 2014-4-6 15:17

xray19 发表于 2014-4-6 11:56
5 e9 z, C, H! m不好意思，昨天没上传上去

您是本文作者嘛，很希望您能对本篇文章进行总结和评价！8 k# a9 i. R: U7 d; m/ O
我刚大致看了下，这里与大家分享下我的看法，希望能起到抛砖引玉的作用。
1 {% K9 ]* \! [: Y2 K1 ^
1. 刚打开文献，查了下杂志的IF，并以为是一篇用4因子（OSNL）诱导鸡体细胞重编程的文章，但看过摘要后发现自己错了，这是一篇”利用重组蛋白探索鸡ESCs 培养体系“的文章，文章具有较好的创新性，给了我一些启发，如在用蛋白介导体细胞重编程后，是否可以利用重组蛋白一直维持干细胞的多能性，甚至创建一种新物种ESCs的培养体系，值得尝试。

2. 文章的思路: A. 用EGFP验证9R的功能； B. 国建pCMV-PF-9R-IRES-EGFP载体，瞬时转染293FT细胞，提取蛋白并浓缩； C. 加到鸡ESCs培养体系中，观察传代次数（一系列的检测指标），发现重组蛋白能抑制鸡ESCs的分化，能在体外维持ESCs的多能性1 `0 E5 t5 `7 y+ n8 ^# l

3. 有一些疑问: 目前哪些物种获得了可以再体外长期传代的ESCs，求高手指教！！！另外文章中超声破碎细胞时的溶液是什么，还有转染效率怎么样（出现绿色的时间和比例，质粒应该没有线性化吧）这点自己比较感兴趣，希望Xray19能告知2 W& q" \; \1 _6 o
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4. 文章整体比较简单，不过也是一个完整的Story，自己推测应该是一名研究生做的工作。顶一个

作者: xray19 时间: 2014-4-6 16:45

回复 Andyhigh 的帖子
# g2 @% ?' J5 R$ Z
楼主好厉害。我不是作者，把文章down下来一直在偷懒没有看，还搞错了文章内容，真的好惭愧。。。。
先不说话，赶紧看文章

作者: xray19 时间: 2014-4-6 17:30

Andyhigh 发表于 2014-4-6 15:17 # |, J+ t, X! O1 a0 }6 _$ c K5 G
您是本文作者嘛，很希望您能对本篇文章进行总结和评价！6 s6 o8 k1 z, l/ k/ j
我刚大致看了下，这里与大家分享下我的看法，希 ...

8 p% O, K; U: D0 y$ ?) w' ^
实在汗呐，下了文章后匆匆瞄了一眼摘要，跟Andyhigh一样，一开始也以为是用四因子蛋白诱导鸡细胞重编程的。大家都在热火火的用转导肽介导四因子造ipsc，这篇文章的作者反其道而行之，由此想到利用转导肽融合的干性因子去阻止鸡ESC在传代过程中多能性丢失，这是做ESC培养基研发的节奏啊。Andyhigh兄已经对文章评价的非常到位了，不多说了。+ [1 O9 |" Q+ V! T) w
文中中超声破碎细胞的溶液应该是PBS吧（cells were washed twice with PBS and then ultrasonically disrupted），若有其它特殊的缓冲液应该会在方法中说明的。* r8 Q3 |8 M- H" Z0 |( |
293FT的转染效率，文章中也没说，但我利用lip2000转染过293FT（文章用的磷酸钙沉淀），效率超高，90%以上了，24小时的GFP几乎就全亮了，48小时达顶峰。
质粒线性化主要是为了稳定细胞系筛选时便于DNA片段插入基因组，瞬时表达时对转染效率和表达量并无助力，所以文章中估计没有线性化。- i* _3 ~% _" @' Q
人和小鼠的ESC是有可长期传代的细胞系的，这个大家估计都知道，置于其它的俺是小白，就不清楚了。倒是可以查下大鼠，果蝇，猪和牛是否有ESC细胞系。

作者: Andyhigh 时间: 2014-4-6 19:23

回复 xray19 的帖子) ~- M7 b& O0 E; ~# }9 D
; ]3 b- n. l9 v: n) ? Z" c
大鼠的ESCs及培养体系有，猪ESCs也有，但是缺乏培养体系，其他的不太确定，估计绝大部分都没有公认的培养体系。

作者: xray19 时间: 2014-4-6 20:09

回复 Andyhigh 的帖子4 @! ~+ e' H6 T* [* o' M% N/ |3 |, y

权限不够，还加不了好友。有机会多就ips 聊聊

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