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标题: 求助：大家在养ips细胞的时候有没有碰到有这种形态的，我现在真的养不下去了。。。 [打印本页]

作者: lion1987007 时间: 2014-4-5 12:04 标题: 求助：大家在养ips细胞的时候有没有碰到有这种形态的，我现在真的养不下去了。。。

如题，我在养ips细胞的过程中有时突然出现这种形态的细胞，而且一出现很快整盘细胞都会变成这样，这样的细胞克隆不仅形态差，而且细胞克隆很难长大，传到基质胶上时会好一些，但是还是没有以前的增值速度，而且是不可逆的，一旦出现了这种形态的细胞，这批ips细胞就基本报废了，请大家帮我分析分析是什么原因？你们在养ips细胞的过程中有没有碰到过这种情况？[attach]60463[/attach][attach]60462[/attach]

作者: wanglimaomao 时间: 2014-4-5 18:53

有可能支原体污染，一般支原体污染，细胞增殖减慢，细胞状态差，但培养基不会有变化。加一些抗支原体的药试试。

作者: 922922922 时间: 2014-4-6 17:50

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一方面有可能是污染，但是也可能是分化了。我的IPS里面有时偶尔会有这种情况，但是不影响其他形态好的的克隆生长。如果怀疑是支原体污染，可以检测一下8 b" V; V; a- {7 F& X# ^7 G6 I

作者: henryjia 时间: 2014-4-6 21:48

你用的什么滋养层细胞？似乎滋养层细胞在大量死亡，至少形态不健康

作者: 芦苇浅 时间: 2014-4-6 22:15

你们的feeder是iMEF吗？好稀啊，我们养ES或iPS时候iMEF的密度要比这大得多才能支持细胞克隆的生长。

作者: 陆萌 时间: 2014-4-8 09:36

感觉MEF有问题呀，一般按60000cells 每平方厘米的密度种滋养层细胞~~' [) ? S4 `4 j/ n8 j- D8 j0 T

作者: Tivah 时间: 2014-4-8 09:53

连feeder带iPS的状态都有点怪，要形容的话好像拿什么固定剂固定过了似的……不过楼主既然说传到基质胶上时会好一些，那可能就是feeder有问题了。
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另：楼主具体检测过这样状态的iPS吗？比如用qPCR测几个marker(或者直接用的oct4-gfp的MEF)?

作者: plainxie192 时间: 2014-4-8 10:08

做个支原体检测看看吧，如果真污染了，直接扔吧，药物也只能起抑制作用，不能完全杀死，注意培养基是否有问题。

作者: lion1987007 时间: 2014-4-9 09:45

回复 Tivah 的帖子 F$ r+ j# h% |% }) ^) @
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这个克隆我们之前已经做过ips鉴定了，确定是正常的ips克隆，开始的时候形态很好，只是突然有一天才发现这种形态的，所以我怀疑是不是污染，但又不像是细菌污染。。。

作者: lion1987007 时间: 2014-4-9 09:48

回复芦苇浅的帖子& r( j" K- v- r" O% G- {0 W
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我们用的是CF-1品系小鼠的MEF，开始接种的时候其实不稀，但是出现这种形态的克隆后，感觉MEF也死了不少，形态也不好了。。。

作者: 碧螺春的秋天 时间: 2014-4-9 09:51

克隆看上去有点黑乎乎的，而且听你描述的挺像是污染了，增殖变慢，不可逆，会导致整盘ips异常。检测下支原体吧，如果真是污染就全部扔掉然后做好灭菌，防止后面的实验还会污染

作者: 芦苇浅 时间: 2014-4-10 10:33

回复 lion1987007 的帖子; u. j4 s1 m4 s& ?
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对，培养ES过程中iMEF是有一定消耗的，如果当ES还达不到传代要求但是iMEF比较稀的时候有两种补救方法。一种是直接收集培养iMEF后产生的ES medium，然后补加到培养的ES中，另一种就是解冻iMEF并向ES中补加一定量的iMEF，从而达到支持ES生长的状态。你可以试试

作者: 葱葱 时间: 2014-4-11 00:23

我养了好久了，一直没培养出iPS，这段时间又出现焦虫了！哎！你的还不错。至少有克隆了！而且是阳性！我之前养饲养层时，ES培养基加进去后饲养层细胞有死亡，后来发现配液有问题，你是否换了培养液了呢？可以考虑一下配液！这是我的建议！另外你能否把克隆初期的照片发给我一张，我想参考一下！

作者: Serene 时间: 2014-4-23 14:25

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你好，我想问下，你们用的饲养层是直接买的么？还是自己提去的胎鼠，要是自己提取MEF的话，使用前要做什么检测么？

作者: shushiqing2003 时间: 2015-1-7 02:05

我觉得这个feeder密度不稀啊

作者: 碧螺春的秋天 时间: 2015-1-7 08:26

可能是支原体污染，建议检测一下

作者: ciweiyuan 时间: 2015-1-7 09:19

回复 Serene 的帖子6 V' F5 i; `4 y/ T. P. F
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要做支原体检测的

作者: wangxiang 时间: 2015-1-7 16:26

1.可能是支原体污染，建议买个kit检测一下。2.feeder体系培养的话细胞形态好坏很看MEF的品质，你这个铺底的MEF看起来有点问题，而且也有点稀疏了吧。3.既然克隆鉴定没有问题，建议转到feeder-free体系里面去养。你这是什么来源的ips呢？

作者: shushiqing2003 时间: 2015-1-20 10:27

我觉得就是长老了。。这是养了多少天的细胞啊？。。2 M- @5 {$ c6 y' r5 k( f/ Y S
如果不行就重新接种一次。。我有时候也会出现这样的情况。。) O, B. v5 ~, A& s P+ G' W2 |
但是重新接种就好了。

作者: cloudycity 时间: 2015-2-3 15:51

好像是分化了，之前也遇到过这种情况，强制挑出来放基质胶上培养，分化好多，不过还是可以慢慢筛···

作者: chenyinan0214 时间: 2015-10-16 23:08

我也是这种情况，这样的iPS根本没用，几天就死光了

作者: 无涯 时间: 2015-11-3 10:10

你这个克隆是人的iPS吧，支原体污染的可能性比较大。还有，人iPS培养基中含有bFGF，bFGF对MEF本身会有一定的伤害，MEF的状态会变差。并且，人iPS接种的饲养层密度要求应该比鼠的iPS低很多，一般1.5万/cm就做够了，多了反而不好

作者: 五仁 时间: 2017-4-10 20:55

看着feed密度稀少，如果铺入的feed量对，有可能是bFGF因子量太多，可以试试降低这个因子的量，可能会有改善

作者: 吃呆猫 时间: 2017-5-17 16:21

我觉得很正常啊，就是刚seed下去的时候是大团快，然后就会成这样，一般大克隆会死，但是周围会长出小克隆

作者: 时一清 时间: 2017-5-20 13:37

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支原体检测

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