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标题: western 疑问 [打印本页]

作者: huangcong1988 时间: 2014-5-7 11:11 标题: western 疑问

最近做western，蛋白分子量大小为，40_55kda,我电泳时间为120min，100V，转膜为100mA，100min，一抗跟二抗稀释均为1：:2000（稀释比例都不算高），结果照胶完全没带，连内参也没有带，这是为什么呢？求大神指点，谢谢了先！

作者: ciweiyuan 时间: 2014-5-7 13:34

你干转还是湿转？

作者: 青云之上 时间: 2014-5-7 15:35

本帖最后由青云之上于 2014-5-7 15:36 编辑 / Z% S+ @+ H& m0 Q5 s

转移效率如何？建议：
1、跑完电泳可以用考马染胶看看你提的蛋白没有问题；
2、转完摸后用立春红染色看下蛋白是否从胶上成功转到摸上了；
3、摸一下一抗二抗的浓度，即从大浓度开始做，尽管会出现非特异性条带，  h# Z9 u9 E# q0 @. V( @( W7 R) X
   最起码条带出来了，然后再已不同的抗体稀释比做，背景深了可以加大
   封闭液的浓度和时间。

作者: huangcong1988 时间: 2014-5-7 16:55

回复 ciweiyuan 的帖子# Z% h2 F* F/ I: |

湿转

作者: huangcong1988 时间: 2014-5-7 16:56

回复青云之上的帖子

跑完电泳怎么看提的蛋白没问题？考染之后胶还能转膜？考染后怎么看能看出蛋白样品没有降解呢？

作者: huangcong1988 时间: 2014-5-7 16:57

回复青云之上的帖子" e4 Z/ ?7 J( O- c- N: o
3 K# U* |3 ?0 B- F
还有，我转膜以后marker都转上了，就不知道条带是不是也一样转上了

作者: ccwei0615 时间: 2014-5-7 18:53

If you would like to confirm the efficiency of transfer, you could stain the gel with commassive blue to make sure most of proteins are transferred.

作者: ccwei0615 时间: 2014-5-7 18:56

回复 huangcong1988 的帖子2 Y) |( P( n& n3 V

Once your protein gel is stained with commassie blue, it won't work again in your following immunoblotting. If your can't see clear individual protein bands in stead of a huge smear, that means your proteins are degraded.

作者: maiweiqian 时间: 2014-5-8 23:33

转膜没转好？抗体有问题？

作者: sc-cxw 时间: 2014-5-15 14:26

湿转可以恒流也可以恒压，我们通常是一张膜60-80mA，两种膜120-160mA.时间为50-60min。你转100min会不会有点过呀？

作者: 晴斗斗 时间: 2014-5-15 15:09

marker条带好么？一抗二抗有问题么？显影液有问题么？

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