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标题: 求助：MSC成骨成脂分化染色问题 [打印本页]

作者: 龟酱 时间: 2014-5-19 23:46 标题: 求助：MSC成骨成脂分化染色问题

本帖最后由龟酱于 2014-5-19 23:53 编辑 7 G6 t1 B7 o5 f! q9 t; u. ^/ G% d1 t, W
4 a) U! F" d9 U
成骨成脂都用的Gibco试剂，但都并不成功，想请教下大家问题出现在哪里。。5 g+ H3 P1 I) U: q3 s
用的细胞是P3代冻存复苏后的MSC，细胞密度到80%时换诱导培养基
成脂：
成脂诱导12天出现少量分散的单个圆形透明颗粒，细胞已经开始老化死亡迹象
染色用的是油红O。。配的是2g/100mL油红O 60%异丙醇（分析纯）40%水，配好后过滤
染色步骤：1 V6 T. |$ h' x2 T4 @7 T
1. 弃去培养基，用PBS清洗, w) V" j% M5 S# S, s" g
2. 4%多聚甲醛固定30min1 d5 p! h; ^" P3 Q% m) Z
3. 弃去多聚甲醛，油红O染色10分钟
4. 弃去油红O，异丙醇(分析纯)清洗5次8 [& u( k- u$ A' ^1 B A
5. 加0.5mL异丙醇观察（24孔板） / x0 ~8 D; e- d; \" R3 b! ]
文献中说用异丙醇清洗2-3次，但每次加入异丙醇后都会飘起许多黑红的片状碎片。。。洗至少5次才能弃去碎片，，可显微镜观察后完全没有染上色。。
不知道问题出现在哪呢？很急。。。

成骨：2 L# G+ F; F: W+ A3 |8 h. l

诱导12天后细胞也出现死亡趋势，而且显微镜观察细胞密集区有很多黑色的颗粒，不知道是凋亡细胞还是钙结节- |9 C3 {! A& r8 K! ?& G! _
) H( s( `# D- _$ X( H) Q
茜素红是用0.5g茜素红粉末和50mL水配的，然后过滤/ b, M2 k" p, P$ G# C
染色步骤：
1. 弃去培养基，用PBS清洗
2. 4%多聚甲醛固定30min
3. 弃去多聚甲醛，茜素红染色3分钟9 Z5 S" n8 f) [4 L1 [6 E
4. PBS清洗2次7 k7 y' Q' N3 D* v( H
5. 加0.5mLPBS观察（24孔板）

显微镜下观察得染色前出现的黑色颗粒变成红色，但是是透光的圆形和椭圆形。。。感觉会不会并不是钙结节？1 Z, P1 L6 I' S- }' ]
5 P7 x; S" V: H/ B: u: m4 h- i
向各位前辈赐教。。。9 |3 x' }. n2 x8 b' m' c6 Z4 B
另外如果大家有诱导成功的照片希望能在这里分享一下，谢谢

作者: leaderhou 时间: 2014-5-26 16:21

我做的成骨和成脂染色都挺好的呀
成脂染色时候4%多聚甲醛固定15min，去除多聚甲醛后最好用异丙醇浸润2次，稍微晾干。油红染色后异丙醇我们没有清洗那么多次，直接用三蒸水或者PBS（延缓脂肪滴破裂）观察照相1 Q( L( s2 P* @$ T
成骨染色0.1%茜素红-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，5min-10min3 t& p& o2 i. F6 B* {7 E
祝实验顺利

作者: light_blue 时间: 2014-5-26 22:16

以下建议：
1.成脂诱导在异丙醇加入之前就能看到是否有脂滴着色，很明显。
2.成骨诱导如果用双蒸水配置茜素红需要调ph4.1~4.3。

作者: yaolutian 时间: 2018-9-19 02:52

回复 light_blue 的帖子 D- p9 y, S- c. k Z
; S" a3 @. p |# m, g0 m8 D/ ?* H
您好，请问调ph是用氨水吗，还是NaOH就行

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