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标题: 求教关于CIK细胞分离及培养相关问题 [打印本页]

作者: bin 时间: 2014-5-26 23:20 标题: 求教关于CIK细胞分离及培养相关问题

各位同行，因为公司最近开展一个DC-CIK细胞的项目，需要我学会CIK细胞的分离培养方法，我试了两次，效果都不怎么样，因此我有几个问题向各位请教：1，血液分离以前需不需要先分离血浆和血细胞，是把血细胞先分离后再从中分离出单核细胞呢，还是全血直接离心分离单核细胞，在这个离心过程中需要注意什么细节？2，淋巴细胞分离液是选用哪个牌子的？分离前需要先预温吗？分离液开封后在4度环境中能保存多久不变质，影响分离效果？3，我用淋巴细胞分离液离心后，血浆层，单核细胞层，分离液层没有明显分层，这个可能的原因是什么？怎么解决？4，DC及CIK培养过程中使用的细胞因子，可以购买医院里面的注射液再稀释使用吗？大家认同的品牌有哪些？常用工作浓度是多少？细胞因子稀释后能放在4度冰箱保存吗？5，CIK细胞在做流式检测时，为什么会出现CD3阳性率特别低的情况，CD56阳性率有90%以上，而CD3阳性率只有5%一下，有谁能帮我解释其中的原因吗？
淋巴细胞分离培养是一个非常注重细节的实验，我提出的5个问题是我在实验过程中遇到的问题，在此仅起抛砖引玉的作用，希望各位同行能相互讨论，祝大家学业，工作顺利！

作者: wagumaxida 时间: 2014-5-27 12:02

本帖最后由 wagumaxida 于 2014-5-27 12:03 编辑 + N1 g0 R- i8 R, O8 |

1.一般不用先分离血浆和红细胞，直接全血; y/ e* j0 @2 f4 u- X) j( N9 M% K
2.一般用ficoll，国产的也可以，常温就行，因为温度会影响分离效果，不同温度分离液的密度会变化，具体可参考说明书
3.原因可能：分离转速不够，分离液温度过高或过低导致分离液密度变化，加入血的时候破坏了界膜，分离液过少" j- X; u, U" f# `) b
4.可以；品牌的话国内外均可，国外的比较稳定，国内批次间差异过大；常用工作浓度请参考培养着指南，一般是100μg；一般现用现配或者分装后冻存-20 t" ^, d" y! @( z9 r% Z0 v
5.正常，可能是刺激成熟的步骤出了问题，可以在添加tnf-α的同时加入超抗原9 B2 Q! t3 |( p. W5 \* M
6.在下愚钝，不一定能帮到你，祝你顺利

作者: 伊诺强 时间: 2014-5-27 14:46

针对分离效果，建议采用合适的转速，采用国外FICOLL，分离前全血可以先用盐水大概2倍稀释，分离效果会非常明显，离心完注意观察白膜层的位置，一般会有一圈贴在离心管壁上，注意吸下来。祝你成功！

作者: 伊诺强 时间: 2014-5-27 14:48

还有一条非常重要，ficoll液分装在离心管后，在使用前一定记得高速离心后再使用，因为管壁上不免会有分离液残留（贴附或者蒸汽冷凝），会影响分离效果！祝你成功！

作者: mtdj1314 时间: 2014-5-27 15:52

全血直接离心分离单核细胞；一般使用FICOLL分离液就可以，一般不需要预温，温度对分离效果有影响，推荐参照说明书；分离分层不明显可能是转速不够，一般是50ml离心管，2000rpm；因子的话我们一般保存在负二十，使用时才拿出来。祝好运！

作者: hankangbio206 时间: 2014-5-28 09:21

1.先把血浆和血细胞进行分离，剩余的血细胞与生理盐水1:1混合
2.分离液选择临床级别，有很多的品牌，按照1“1比例加入上面的混合液，加的过程要慢
3，分离单核细胞的时候要设置离心机，转速升0降0，即可梯度分离
4.一搬细胞因子放在4度一个月没问题。

作者: 牵着蜗牛去散步 时间: 2014-5-28 09:45

最好是先分离血浆和血细胞。离心机转速不能太快。

作者: bin 时间: 2014-6-5 09:19

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分离血浆的时候，需要用盐水稀释吗？我做过不稀释和1:1稀释的，2000转20分钟根本分不开细胞和血浆，你们怎么分离的。

作者: bin 时间: 2014-6-5 09:23

回复牵着蜗牛去散步的帖子

分离血浆的时候，需要用盐水稀释吗？我做过不稀释和1:1稀释的，2000转20分钟根本分不开细胞和血浆，你们怎么分离的。

作者: xinquan15 时间: 2014-6-18 09:40

1.需要分离血浆和血细胞，分离后血细胞用生理盐水稀释，稀释比例为全血：生理盐水=1:1；血浆灭活离心后可以在后续培养中按1％左右比例添加，培养效果不错，全血分离为血浆和血细胞可用700-900g离心力15-20min；# _" r1 x2 x1 [5 l+ @- }6 W4 B
2，淋巴细胞分离液品牌较多，如GE，索莱宝，天津灏阳等，4°取出要恢复到室温，一般洁净间为恒温很湿的环境，所以恢复就好，室温太高，会影响分离效果；4°保存1个月不会有影响；
3从以下几个方面考虑：) V# z; y7 e8 [9 U0 m; z/ W8 I
1）离心机性能，好的离心机是质量和效率的保证；2）降速是否平稳，除了设置还是和离心机性能有关；3）淋巴细胞分离液的品质和温度4）少数与血源质量相关；
4，DC及CIK培养过程中使用的细胞因子，可以购买医院里面的注射液再稀释使用吗？大家认同的品牌有哪些？常用工作浓度是多少？
因子常规使用GM-CSF,IL-4,,TNF-α，抗CD3，CD28，IFN-γ，IL-1α等，目前多种国内的因子已经被应用，品牌和批间差异较大，您还是要多查文献，做预实验，找适合培养体系，保证质量，成本又低的最佳组合；因子稀释后如CD3可以在4°，多数推荐-20°保存，并且每次按需配置，避免反复冻融；0 X! q0 M; b3 U6 L
5，我这流式出现您说的这种情况较少，不再发表意见，一般绝大多数CD3阳性，倒是DC刚开始出现86高表达，一直没找到原因。( Z; A$ Y4 G# Y+ A1 y+ Q
意见粗浅，期望大家多交流

作者: lyj-0017 时间: 2014-6-18 10:41

回复 bin 的帖子! b% Y% L' \8 _0 V
; A# X8 Q" Z5 L2 u! A2 G
前面的问题大家都说的挺多的了，至于第5条流式检测，你确定你的CD3和CD56阳性率没有弄颠倒？流式检测与很多因素有关，细胞培养好坏是一前提，细胞染色、上机检测参数设置、后续分析都有可能造成结果不理想，可否把过程说一下？

作者: meister 时间: 2014-6-27 15:51

回复 bin 的帖子, O) h/ W3 D1 a8 ]

是流式分析操作错误，不会有以上结果。

作者: zhanglu8677 时间: 2014-7-11 11:29

2000转20分还分不开血细胞跟血浆?每个离心管装的体积是多少毫升？降速调到0了吗？

作者: yanglixia 时间: 2014-7-31 09:16

回复 bin 的帖子
0 m. b! _ m+ q3 s! t3 [$ r" l" B
分血浆不用稀释，要不血浆就不能用了，全血直接离心就行3000rpm10-15min9 s. \1 ?, h: C5 {+ B

作者: rongrong12662 时间: 2014-8-6 17:04

CIK细胞在做流式检测时，为什么会出现CD3阳性率特别低的情况，CD56阳性率有90%以上，而CD3阳性率只有5%一下
很可能是抗体孵育的时候标记错了，或者上样的时候顺序错了。一般cd3在90%以上，cd56结果较低，建议重新做一下

作者: 小梓莜 时间: 2015-4-10 15:45

回复 hankangbio206 的帖子$ c9 C7 R7 }- w" B
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你好，看到你回复的帖子，想问下你的离心机是什么品牌的？如果转速升0降0，那分离一份PBMC需要多长时间？谢谢指导

作者: 细胞海洋 时间: 2015-4-10 16:33

回复小梓莜的帖子1 J# w$ G, B: o4 O. M7 S4 B/ l" L
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