干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站
标题:
拟胚体实验
[打印本页]
作者:
a279915845
时间:
2014-5-28 21:03
标题:
拟胚体实验
求助：哪个大神能提供一下拟胚体实验的详细步骤啊，我做EB时怎么没几天就贴壁分化了呢，中间需不需要别的处理
作者:
scottist
时间:
2014-5-29 08:25
回复
a279915845
的帖子
/ t( l. ]% m l( i: j9 ^
) ], \7 R7 M( l% X& @1 M
hiPSC和miPSC步骤 不一样，不知道你养的是哪一种？
作者:
a279915845
时间:
2014-5-29 08:33
回复
scottist
的帖子
3 V) f; l2 Q1 b7 w, u4 K
2 l& z6 b4 W$ d. p* i1 _
我养的是大鼠iPS细胞，求详细步骤，谢谢
作者:
scottist
时间:
2014-5-29 08:35
回复
a279915845
的帖子
5 K% M: i- G- c0 `, E
: E3 H) ~7 w/ m1 {. ]
miPSC直接加入到分化液中即可，用低吸附培养皿或培养板，密度最好不要太高；hiPSC最好在低吸附的培养皿或培养板中加ipsc培养液中继续培养12-24h，形成一些细胞团后，再移入分化液中培养，这样形成EB的数量更多一些。你养的没几天就贴壁分化了可能有两种原因：1，培养皿或培养板低吸附处理效果不好，我们用的corning的低吸附6孔板从未出现EB贴壁的情况；2，EB密度过大，出现粘连，最后形成一大团，下沉贴壁，这样的话减少一些密度，或者经常摇动。
作者:
zm19900508
时间:
2014-5-29 08:47
选低吸附的培养皿或培养板，我们用分子克隆实验使用的平板，挺好
作者:
a279915845
时间:
2014-5-29 10:22
回复
scottist
的帖子
u3 O2 d1 P7 R/ h8 T
; k- i" B1 X1 M
非常感谢你的帮助，我使用的是普通的低粘附的6孔板，如果是6孔板一般您按什么密度铺啊，中间换不换液啊，怎么换液啊，离心？分化液就是去除LIF的ES营养液吧？
作者:
scottist
时间:
2014-5-29 10:58
回复
a279915845
的帖子
; @8 O/ c4 ^ a1 H; i. d
/ {( v) C- O" M' l2 e4 d' A
miPSC的话，6孔板每孔加2X10的5次方，换液有人采用半数换液，这样貌似损失很多，可以用离心换液，最好不要用枪头，用移液管，轻吸轻吹。分化液我们以前用加15%FBS的DMEM，只去掉LIF，还加KSR的话，分化效果可能不如加FBS效果好。
作者:
scottist
时间:
2014-5-29 10:58
回复
a279915845
的帖子
4 o* J8 |" n; B) ?3 _( e- c
; H! r7 U" H! u6 o3 [+ f
miPSC的话，6孔板每孔加2X10的5次方，换液有人采用半数换液，这样貌似损失很多，可以用离心换液，最好不要用枪头，用移液管，轻吸轻吹。分化液我们以前用加15%FBS的DMEM，只去掉LIF，还加KSR的话，分化效果可能不如加FBS效果好。
作者:
scottist
时间:
2014-5-29 11:00
回复
a279915845
的帖子
}1 w5 F9 }5 ~/ h4 O$ Y' g
; f& e$ M8 h/ t/ \6 e/ M) o
miPSC的话，6孔板每孔加2X10的5次方，换液有人采用半数换液，这样貌似损失很多，可以用离心换液，最好不要用枪头，用移液管，轻吸轻吹。分化液我们以前用加15%FBS的DMEM，只去掉LIF，还加KSR的话，分化效果可能不如加FBS效果好。大鼠iPS我没养过，EB培养步骤就不敢妄言了。
作者:
a279915845
时间:
2014-5-29 12:19
回复
scottist
的帖子
) H4 f. f8 b, U% Z
a; u' C% z( a- @1 R
非常感谢您
作者:
穿裙子的猫
时间:
2014-10-8 16:41
回复
scottist
的帖子
, Q/ R* v, g1 P/ R2 o7 d
/ M4 E. @7 x! j9 z
你好，我看了你的回复，受益匪浅。请问你做过拟胚体的诱导分化吗？是直接贴壁诱导还是悬浮成单细胞？
作者:
scottist
时间:
2014-10-8 16:55
回复
穿裙子的猫
的帖子
i' K9 U9 V1 h7 E9 ~
8 \! R8 v# B0 Z6 c% t4 k) _
我做过悬浮诱导。hiPSC消化为单细胞，置于低吸附培养板中，分化培养液中加入诱导因子诱导。
作者:
穿裙子的猫
时间:
2014-10-8 18:30
回复
scottist
的帖子
0 X8 S" _8 q8 b! Z3 J' k
# u4 H" ?- {3 T* \+ J/ h5 H
万分感谢你的回复，消化成单细胞再做悬浮分化培养？你做的分化成那种细胞啊
作者:
scottist
时间:
2014-10-9 09:06
回复
穿裙子的猫
的帖子
, Z' d z, n4 a A/ K+ V, q" M
4 k% J+ ~( v! j( F/ ]
我做的是hiPSC向造血干细胞分化，参考的文献，先向中胚层诱导，然后换一组诱导因子，继续向造血干细胞诱导。
作者:
sylar.wy
时间:
2014-11-4 20:08
回复
scottist
的帖子
9 t& B9 y1 @. ], l( C8 g
+ s) w4 u) U- }' w# d; B- J- o
您好，请问下离心换液用移液管转移后是要多少转离心呢？自然沉降可以吗？
e0 U' V4 ~& b0 k# F/ C
# C; S9 |: D/ n8 P' A5 V
有做过悬滴分化吗?知道怎么换液吗？
作者:
scottist
时间:
2014-11-6 09:09
回复
sylar.wy
的帖子
4 n' R) U/ b& I4 p1 W& U; W& S
! `0 ?( a! d* Z- p U- c
悬滴分化我没有做过。直接加到低吸附6孔板养的，换液的时候300g低速离心就可以，动作要轻，建议用滴管，避免对EB的机械损伤。
作者:
sylar.wy
时间:
2014-11-6 10:51
回复
scottist
的帖子
1 I2 p N; U7 g) P
! t( {0 c! `9 F7 F( M4 j
谢谢啦！
作者:
shushiqing2003
时间:
2015-1-20 10:39
回复
scottist
的帖子
4 N0 s' c/ ]$ b1 S4 R
' s p6 Q7 l# h4 \' N# A
我也要做EB的造血干细胞分化，求交流！！！！
作者:
细胞海洋
时间:
2015-1-20 21:34
回复
shushiqing2003
的帖子
7 T$ F: y( E+ ^' g" l( _+ H0 l8 a6 U
5 z% a n( q ?3 g, h' U i
请直接说明你的问题
G/ m. {. J6 G
欢迎光临 干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站 (http://www.stemcell8.cn/)
Powered by Discuz! X1.5