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标题: 请问一下，如何确保6孔板中每个孔加50个肿瘤细胞？ [打印本页]

作者: cyz3057 时间: 2014-6-1 16:19 标题: 请问一下，如何确保6孔板中每个孔加50个肿瘤细胞？

如题目所述，现在做细胞，看文献有说要每孔50个细胞，这个换算下来应该每孔加多少ul的单细胞悬浮液呢？

作者: 碧螺春的秋天 时间: 2014-6-1 17:36

先计数，看悬浮液里细胞密度，然后根据密度和所需要的细胞数目算出应加体积

作者: genedu 时间: 2014-6-2 14:34

计数比如说 10*6 / 1ml，然后按照梯度稀释法，注意不要稀释过度，按照10倍的稀释最好（100μl-900μl），注意每次都要充分混匀，最后补充至2ml培养基，铺板即可

作者: tiramisu 时间: 2014-6-3 10:22

先按照细胞浓度稀释相应倍数，再用细胞计数板显微镜下计数。

作者: 仰天 时间: 2014-6-3 11:01

不知道你细胞生长的是否很密，像我的话细胞比较密，每次计数前我会先稀释10倍或者20倍，这样计数的时候细胞不会太密，比较好计数一些。计数完了以后比如你要接8个孔，你可以计算10个孔需要的细胞数，然后补充培养基充分混匀后吸相应的体积加到孔里面。这样比你一个个孔加50个细胞会更准确一些，毕竟50个细胞有点少，枪头稍微残留一点的话误差会比较大

作者: cyz3057 时间: 2014-6-3 22:46

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嗯好的

作者: cyz3057 时间: 2014-6-5 08:10

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哦不好意思这几天实验忙的再请教一下哦那我现在要计数培养瓶内的细胞数里面有3ml的培养基我消化后离心用3ml培养基重悬成单细胞悬浮液取多少体积的细胞悬液用来计数呢

作者: cyz3057 时间: 2014-6-5 08:11

回复 tiramisu 的帖子. J$ O" B8 u7 o2 p- j

恩恩 thanks

作者: cyz3057 时间: 2014-6-5 08:16

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哦谢谢哈我的细胞昨天看了下基本能长到70%左右的样子我不大知道在计数时滴多大体积的细胞悬液网上都说滴一滴这样到时怎么能够知道滴了多大的体积那总的细胞数又怎么知道呢

作者: 仰天 时间: 2014-6-5 15:10

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我们细胞计数都是用计数板的，就是一个载玻片和一个盖玻片，显微镜下在载玻片的中央位置是计数位置，该计数位置有四个大正方格，每一个正方格又由小的16个正方格组成。计数的时候盖上盖玻片（盖在计数位置上），吸取10μL的细胞悬液打到载玻片和盖玻片的间隙中，不要有气泡。然后你计数，举个例子你在四个大方格计数是10，20,15,15，那你最终的细胞数是这四个数相加除4，然后乘以10^4，即15X10^4/mL，也就是说你计数的原液中，每mL中含有15X10^4个细胞。然后你再根据你要加的细胞数计算你要吸取的体积。

作者: cyz3057 时间: 2014-6-6 09:02

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恩恩，好的，昨晚做实验就用了这个方法计数，不过没做好，第一次估计细胞密度，担心细胞密度不够，直接悬浮了四瓶细胞，为了均一性，将四瓶细胞混在一起了，最后又弄的密度很大，又得稀释。请问一下哦，你们做细胞实验，怎样避免每瓶细胞之间的差异性呢，还是忽略不计。谢谢指导。

作者: 仰天 时间: 2014-6-6 17:30

回复 cyz3057 的帖子9 r9 Z. A% v* T0 p, w

可能是我做的不够严谨，对于同一种细胞如果要几瓶或几皿一块消化，混合起来一块离心的话，我还真没有考虑过不同瓶子或皿中细胞的差异性。如果需要考虑差异性的话，能告诉我为什么吗？谢谢！

作者: cyz3057 时间: 2014-6-10 09:20

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哦我和师姐也交流了一下基本不考虑每瓶细胞之间的生长状态的差异我个人觉得如果做提取rna 蛋白等可以忽略不计但是做比如分析生长周期等还是要注意一下比如采取同一细胞不同培养瓶分组去测细胞的生长周期

作者: 仰天 时间: 2014-6-10 09:32

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谢谢，因为没做过生长周期方面的实验，所以对这方面就没注意过。

作者: cyz3057 时间: 2014-6-10 11:27

回复仰天的帖子; @9 u) R/ [4 W# ?- O
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哦客气的以后多交流

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