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标题: 求助-小鼠颗粒细胞传代 [打印本页]

作者: moluxingke 时间: 2014-6-1 17:01 标题: 求助-小鼠颗粒细胞传代

最近做小鼠颗粒细胞的体外培养，常规刺破有腔卵泡取coc，消化后培养颗粒细胞，很多方法都是提到透明质酸酶或是反复吹打使颗粒细胞和卵母细胞分开，想请教一下，如果说培养的时候不移去卵母细胞，而是将卵母细胞和颗粒细胞共培养，会对培养的颗粒细胞有什么影响？培养的原代颗粒细胞可以传代几次？有做的人分享一下经验呗。

作者: aulenuyah 时间: 2014-6-1 17:48

卵母细胞与颗粒细胞共培养的话卵母细胞应该会成熟，颗粒细胞应该会凋亡；
我之前做过山羊的颗粒细胞，前后一共传了八代左右吧，不过颗粒细胞体外培养比较麻烦，要注意条件

作者: 墨如 时间: 2014-6-1 18:00

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作者: moluxingke 时间: 2014-6-2 10:35

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嗯，谢谢了，我做小鼠的颗粒细胞原代培养，想得到的细胞更多一些，就试着把已经长好的细胞给传了代，用胰酶消化的，结果悲剧了……传代都快十个小时了，细胞还在培养基中游泳……

作者: aulenuyah 时间: 2014-6-2 14:14

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按理说颗粒细胞是可以穿戴的呀

作者: moluxingke 时间: 2014-6-3 15:15

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嗯，可能是我处理过程出现问题了，也许是胰酶消化时间长了。说到这个问题，我想问一下，你收集山羊颗粒细胞的时候，是用什么方法将山羊颗粒细胞分散开的？小鼠的COC颗粒细胞之间连接的好像比较紧密，不像排卵后那样，用枪一吹就散开了，这个时候用枪吹打很费劲的，用透明质酸酶消化吧，又担心对颗粒细胞生长贴壁有影响。

作者: aulenuyah 时间: 2014-6-3 23:12

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首先将获得的颗粒细胞加入D-Hanks混匀离心，之后加入培养液吹散就可以了，我没有使用酶来消化，原代培养的时候最好不要用酶消化，透明质酸酶确实可以把细胞分散，但是透明质酸酶消化后的颗粒细胞贴壁特别差；另外，建议适当加一点点激素（比如FSH），这样细胞长得会好一些。

作者: moluxingke 时间: 2014-6-3 23:42

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多谢。再多问一句，刺破卵泡释放出COC的过程中，其实也伴有许多颗粒细胞释放出来的过程，当拣出COC的时候，其实剩下的除了残破的卵巢碎片外，还有很多散落的颗粒细胞，那么这些散落的颗粒细胞能否收集？一些大的卵巢碎片能否通过过滤除去？毕竟只收集COC上的颗粒细胞数量有点少了。

作者: aulenuyah 时间: 2014-6-5 15:24

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这就要看你到底要收集什么细胞了，如果只需要颗粒细胞，而且不分到底是卵丘颗粒细胞还是壁层颗粒细胞的话，是可以收集的。' d% Z s3 u7 {. }
如果你有体视显微镜的话，可以直接在显微镜下把大块的碎片捡出去扔掉，剩下的基本上就是颗粒细胞了。

作者: moluxingke 时间: 2014-6-5 17:09

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这样也可以？剩下的小碎片里面不会有其他细胞污染吗？比如卵巢表皮细胞或是膜细胞等？主要就是担心这个。

作者: aulenuyah 时间: 2014-6-5 18:18

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如果轻轻刺的话，可以忽略的，而且你说的这两个细胞的原代比较难养，就算有也会很少的

作者: moluxingke 时间: 2014-6-5 22:20

回复 aulenuyah 的帖子& f# o8 w1 _+ W8 L

谢谢，在培养的第一天没有把卵母细胞分离出来，然后等颗粒细胞贴壁了，第二天换液的时候才将卵母细胞移除，对颗粒细胞的生长有影响吗？8 h% k! i5 ?. {: W& W

作者: aulenuyah 时间: 2014-6-6 15:08

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卵母细胞和卵丘细胞共培养后，卵母细胞会成熟，而卵丘细胞会发生凋亡。所以最好别这样培养

作者: apsuifeng 时间: 2014-7-28 17:28

首先更正一下，这个叫法是不科学的，准确来讲应该叫卵丘细胞，这个细胞培养起来应该是比较简单的，如果与卵母细胞一同培养，有一个问题，培养基你应该用什么呢？我原来培养卵母细胞时会暂时不吹打，培养8个小时时吹打是比较好做的。不知是否解答了你的问题。

作者: monk125 时间: 2014-7-30 15:41

我看到过一篇science 说是颗粒细胞与卵母细胞共培养的卵母细胞在有无颗粒细胞情况下都会自然成熟另外，我见到别人养的颗粒细胞一般都是培养72小时就不养了估计如果不加特殊培养条件颗粒细胞会分化或者凋亡吧

作者: monk125 时间: 2014-7-30 15:44

这边实验室是用体视镜取出卵母细胞然后剩下的颗粒细胞再用淋巴细胞分离液收集我用FSH CD45这两个标记测过纯度，大约收集的颗粒细胞纯度约80%-85%，会有淋巴细胞污染。我们也在想办法进一步提高颗粒细胞的纯度，如果你有更好的办法，欢迎指教。

作者: moluxingke 时间: 2014-10-18 09:58

回复 monk125 的帖子. I Z* L" l, A7 J* Q0 n. B8 f. ]

前段时间一直没有再做颗粒细胞培养，不过这几天又开始了，现在方法依然不太成熟，我现在打算这样做：首先是小鼠超排，然后刺破卵泡，先把COCs给拣出来，然后吹打使卵丘颗粒细胞散落下来，将这些颗粒细胞单独培养。对于刺破卵泡后残余的颗粒细胞和卵巢碎片混合物，我用细胞筛滤了一下，将那些大的卵巢碎片出去，剩下的大部分应该是颗粒细胞了，当然里面肯定混有其他的细胞类型，然后培养。然后将两组细胞比较一下，检测一些颗粒细胞markers的表达，看看差异有多大。8 t' l* d# q8 d" i e7 u7 k4 C
只是还有一个疑问，壁层颗粒细胞和卵丘颗粒细胞在体外培养的情况下，它们的特性是否恢复一致？

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