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标题: 流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗 [打印本页]
作者: qing蓝qing    时间: 2014-6-13 09:11     标题: 流式检测，先固定细胞一段时间（几天），再加荧光抗体对结果有影响吗

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我想请教一下，我的荧光抗体没有到货，但是需要检测此时的CD分子表达情况，可不可以先将细胞用甲醛固定，等荧光抗体到货后在反应上流式？
作者: ciweiyuan    时间: 2014-6-13 10:00

我以前固定后24小时做免疫荧光共聚焦木有问题
作者: rocfield    时间: 2014-6-13 10:02

应该是不行的，流式一般是先抗体标记，再固定的。
; o6 h: H+ }9 N$ Y% h先用甲醛固定会影响蛋白构形，改变抗原决定簇的三维构型，影响蛋白与抗体的结合，造成假阴性结果。
作者: 仰天    时间: 2014-6-13 10:34

最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻存或者传代，等抗体来了再做流式。
作者: qing蓝qing    时间: 2014-6-13 13:23

回复 仰天 的帖子( H8 `) X- @0 e5 c; q
) T) F& ^* N7 C+ [, ^
细胞无法冻存的话怎么办?冻存再复苏，不影响流式结果吗？
作者: qing蓝qing    时间: 2014-6-13 13:24

回复 rocfield 的帖子
; F) S, Z* c2 w$ \$ `$ |) ^- W, x# |/ }% h& }0 _
http://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771
/ t+ ~9 j; l0 O' bA. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：3 `( p2 w- V4 B" v" j% B% P
(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。9 N) n5 n$ V6 o' _/ d
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。
7 }/ A% a6 L  L+ [(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
# Q' r  O4 c5 u- X(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。
; z8 l2 q" k4 e7 B7 e这不是流式的标准操作吗？
作者: qing蓝qing    时间: 2014-6-13 13:25

仰天 发表于 2014-6-13 10:34
) [- I! |/ g: o最好不要这样，我们实验室做流式没有提前用甲醛固定过，都是收集细胞后马上做流式。细胞如果长密了你可以冻 ...

6 a, ~$ B+ R8 Y8 {0 |% z6 shttp://www.dxy.cn/bbs/topic/7407771 5 x( M; g) D8 z) J+ {+ ~# P- M% t
A. 直接标记抗体（FITC标记抗体）：
( ]7 C. J6 f1 r% f1 N(1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。* L0 B+ U( S* ]- M
(2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。; S+ I! @+ `4 e! x6 h5 V
(3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。
) e9 }+ d8 y" z: j* k* [(4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。: v. C7 `3 ^: q: Y0 _- \* L% H; v
作者: rocfield    时间: 2014-6-13 16:26

回复 qing蓝qing 的帖子
; D% u4 B8 h9 s- x6 Y1 A0 _7 i, E7 u2 y: ]  @" M
不知道您的这个流程是从哪里查到的？
+ C, N" e9 e7 f我们做的大致是这样的：
9 F- s! }$ B2 ?! I$ ]0 |  ?0 O1：收集的细胞用PBS洗一次；$ c/ ^& A/ I. \& q* N8 X8 M; j. J6 \
2 重悬细胞后加荧光抗体，室温或4度孵育15～30分钟；% f6 l  s& z6 q+ O
3 PBS洗两次4 P0 o* U+ ]+ e* j
4 用4%多聚甲醛重悬细胞，4度保存直至上机检测（据说一周内检测都可以，我们只做过4度放了3天的，检测结果没受影响）9 |& J  W2 i+ _, y. G+ N& y
如果当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定，直接用PBS重悬后上机检测就可以了。
作者: qing蓝qing    时间: 2014-6-13 16:40

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2 W; _# z$ K/ j% n( ]- L4 u3 C6 M$ t& Z/ x6 S! n
谢谢指教
作者: shaozi402    时间: 2014-6-13 21:38

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8 ~1 U" h4 T. Q/ D, W" p
  a; e4 a" x4 M- s& k检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？
作者: shaozi402    时间: 2014-6-13 21:38

回复 shaozi402 的帖子
# ^# y1 f) F$ [1 D. Y
( l0 c: D0 |3 _, ?, b, ^表明抗原检测的话，多聚甲醛固定会影响结果吗？1 a1 Y2 u2 T1 `& [" _
作者: rocfield    时间: 2014-6-16 12:24

shaozi402 发表于 2014-6-13 21:38
0 B$ C" h9 S7 Z7 j$ S3 g2 r+ X回复 rocfield 的帖子
) p* Q1 |" V+ S5 b5 Y7 M/ c! I( i( F" j, e
检测表明抗原的也需要多聚甲醛固定吗？
( b' p9 N5 P. i7 x" t/ u
如果标记完当天可以上机检测的话，不用多聚甲醛固定效果更好。0 g5 ?, J* Y% q" Q
如果标记完不能马上上机检测，必须要用多聚甲醛固定，上机之前4度保存。- a' |: i' k  k4 P/ d7 n/ `
作者: shaozi402    时间: 2014-6-16 17:17

回复 rocfield 的帖子5 p3 q! [6 z* `' ^. n/ T
1 O3 p: j. [7 d6 l9 }- W7 V
明白了，谢谢3 e% @: V: s! y* d. |2 p
作者: shaozi402    时间: 2014-6-16 17:18

回复 rocfield 的帖子
2 a" ?2 j% m  U' R. |" W  R4 W1 y. `0 E4 O2 u* v1 v
用多大浓度的多聚甲醛
+ o" w1 [9 T, p1 A
作者: rocfield    时间: 2014-6-17 08:52

回复 shaozi402 的帖子3 @/ o3 X& V. {( I# x  U
" j) F; R4 m2 ^
4%或1%的都行
作者: shaozi402    时间: 2014-6-18 10:33

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7 @' o/ _" U+ I: `) S1 T8 k# r1 z. G' A& v& o- q3 K
好的，谢谢
作者: xmq198645    时间: 2017-8-11 16:02

看来还是要先标后固定啊
作者: 阿秀哥    时间: 2017-8-15 09:14

一般都是先孵抗体，然后不马上上机才固定的



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