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标题:
关于CFU，成集落培养的问题
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作者:
洛古16
时间:
2014-7-21 13:57
标题:
关于CFU，成集落培养的问题
请问，各位大神，
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1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？
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2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？
作者:
子非鱼
时间:
2014-7-21 15:25
脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。
作者:
洛古16
时间:
2014-7-21 16:06
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子非鱼
的帖子
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# `: q& O) ]. p& y& |$ f
甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？
7 W$ _8 Y- x5 B# f1 ~3 K% n( m$ Y
培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？
. w L4 W4 ]0 L
还望不吝赐教啊，谢谢
作者:
子非鱼
时间:
2014-7-21 16:25
你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。
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你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。
$ c& t \2 R( n* @
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。
作者:
jjjddf
时间:
2014-7-21 16:27
我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算
作者:
洛古16
时间:
2014-7-22 09:36
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子非鱼
的帖子
& \8 Z2 C7 x- I s
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有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。
+ a( Y$ @. V" q) r8 P$ x# h
那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？
: h2 w* T$ H# I) Y
刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。
作者:
子非鱼
时间:
2014-7-22 14:50
我主要也是做的造血干细胞的集落。
+ H: |6 o, T4 J! k7 @; i c
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
& O7 @2 o; U' N8 y) p; F. O
集落重铺
9 d4 w4 v+ i7 Z) j# D6 s& p
注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
: m7 n+ p/ p2 o$ _
材料/试剂
* t. C7 a" f# A. g3 V7 x
除非特别说明，所有材料均需灭菌
& c. u+ V! `/ J: x! R
(1) 带通风设备的超净台
0 ~1 E8 D# E& x$ ~/ C8 K' e
(2) 倒置显微镜
( U3 A! {& X- h. Y; ~7 |; j* U4 P+ u, _
(3) 20ul微量移液器
, e6 c. C* E1 U: t6 E
(4) 含青霉素/链霉素的IMDM
, f" p( c3 H& D5 u
(5) 12mm×75mm聚丙烯试管
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收集集落步骤
5 ~: g" l1 `) j& Y
所有步骤均需无菌操作。
5 n5 K8 Y- ?+ s/ f
(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。
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(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
' z- C c+ a+ R' d; Y
(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
/ ]6 d6 i. N$ B
(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
d, A/ X6 r% s& V T
(5) 找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。
' E2 L, b7 [5 d4 }2 M! A9 R+ Y
(6) 单独存在的集落最容易收集。
* a5 R$ o0 q6 q" H, G7 [, Z) F! ?
(7) 将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。
% w. W$ m! d2 _& A: l; F
(8) 集落收集完毕后，进行铺板操作。
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集落收集后的铺板步骤
" Z" B ]' v2 I* n0 [
所有步骤均需无菌操作
7 Q; V. k* o& V$ ^
(1) 计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。
& ~6 N3 l8 n6 B" k5 x% X, O3 ?
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
" T9 n2 z9 p x& ^) { c* `; u
(2) 当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
& s" U* X! I/ j! p& y+ v' C4 v8 a
(3) 静置。
1 t& A( c" l/ S& G9 y* \6 r* `+ c0 ^
(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
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甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
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(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.
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作者:
洛古16
时间:
2014-7-23 08:48
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子非鱼
的帖子
' r8 h) W1 E8 |7 l
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哈~~~非常感谢
作者:
洛古16
时间:
2014-7-31 11:43
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jjjddf
的帖子
% y9 f( r9 T- n
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15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊
作者:
jjjddf
时间:
2014-8-4 14:41
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洛古16
的帖子
9 u; M; E6 h0 x. O! c& C! U) R
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我们用的是吸量管
作者:
洛古16
时间:
2014-8-5 08:29
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jjjddf
的帖子
- B- G7 b$ b8 }) x
& P7 K3 \/ E( }9 Z
吸量管会损失很多么？
4 f( k/ p& N; g8 W
对了，集落计数的时候，下面这种情况怎么按几个算呀？
8 u& j+ @ |! q/ x, U8 p3 m
作者:
洛古16
时间:
2014-8-5 08:42
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jjjddf
的帖子
' X5 Z+ b0 [# A+ \4 v
- s) p, g0 Y+ [' f3 u
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