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标题: 关于CFU，成集落培养的问题 [打印本页]

作者: 洛古16 时间: 2014-7-21 13:57 标题: 关于CFU，成集落培养的问题

请问，各位大神，
1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？! K3 ~1 }4 ~# W L$ {8 ?
2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

作者: 子非鱼 时间: 2014-7-21 15:25

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

作者: 洛古16 时间: 2014-7-21 16:06

回复子非鱼的帖子! m8 Y5 r5 d- i0 U1 y! K

甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？; Q. E# f1 `% T. O" ]2 w2 j# `2 q( ?
培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？
还望不吝赐教啊，谢谢

作者: 子非鱼 时间: 2014-7-21 16:25

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。
你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

作者: jjjddf 时间: 2014-7-21 16:27

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

作者: 洛古16 时间: 2014-7-22 09:36

回复子非鱼的帖子
$ `+ f9 J8 m; b6 z! ?
有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。5 t5 M, B7 k; e
那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？/ L9 I( e& [% t2 @5 _5 b5 ]& j
刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

作者: 子非鱼 时间: 2014-7-22 14:50

我主要也是做的造血干细胞的集落。3 h8 t+ u0 t; Q- }* E0 s: J
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。5 |/ P$ `' ~3 }0 p% |
集落重铺) L1 Z- w' ^# i' d
注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。! ]6 N- B% u- Y. c- c: f" x6 w+ l% [
材料/试剂% \4 L/ m* _! z: B+ w
除非特别说明，所有材料均需灭菌0 P" |7 m2 o$ S: n5 |
(1) 带通风设备的超净台$ J% l# E4 o, S, F- X
(2) 倒置显微镜+ k: f3 [" i. k7 z
(3) 20ul微量移液器
(4) 含青霉素/链霉素的IMDM) ~1 U1 q( b% Z7 f+ s% p
(5) 12mm×75mm聚丙烯试管
收集集落步骤1 O* J) l: E& l5 k( A
所有步骤均需无菌操作。
(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。
(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。2 e9 E% E9 p& R! L! i
(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
(5) 找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。
(6) 单独存在的集落最容易收集。
(7) 将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。, r% u b% z* P5 c: R# B `
(8) 集落收集完毕后，进行铺板操作。8 ^: i: D6 J+ Y! x8 [+ c! a* z
集落收集后的铺板步骤
所有步骤均需无菌操作
(1) 计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。 y% Z( h( r x/ f) ^
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
(2) 当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
(3) 静置。
(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。. x9 D: m# }% j' h
甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。6 e- l( T6 a4 A- k) l
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.

作者: 洛古16 时间: 2014-7-23 08:48

回复子非鱼的帖子" i. s/ ^7 y& _: c. M

哈~~~非常感谢

作者: 洛古16 时间: 2014-7-31 11:43

回复 jjjddf 的帖子; X8 y0 A: ?! ]( ~9 R9 h1 u5 N
- T* x8 v7 o! {9 |
15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

作者: jjjddf 时间: 2014-8-4 14:41

回复洛古16 的帖子- A/ `+ h& C& n. O

我们用的是吸量管

作者: 洛古16 时间: 2014-8-5 08:29

回复 jjjddf 的帖子

吸量管会损失很多么？( \# ^3 I% Z+ }9 c& T- k& f
对了，集落计数的时候，下面这种情况怎么按几个算呀？; }' T7 A' d& F" j& r; H. L- _

作者: 洛古16 时间: 2014-8-5 08:42

回复 jjjddf 的帖子9 w. Z! q: @; v5 [# E. e- N
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