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标题: 关于RT-PCR [打印本页]

作者: moluxingke 时间: 2014-8-11 13:28 标题: 关于RT-PCR

最近在做反转录PCR，组织提取RNA，然后反转cDNA，稀释大约500以后再做普通的PCR，用了36个循环，结果跑电泳的时候发现GAPDH亮度差异很大，按理来说，用1ug的RNA反转，cDNA含量应该差不多的，但是经过PCR之后内参差异怎么会这么大，有时候做Real time也是这样，同样的RNA反转之后，GAPDH的CT值有的是15，而有的就是16了。提RNA后测浓度有的大于1500ng/ul，也有的不到500ng/ul，是不是反转的时候把RNA浓度调到一样的浓度会好点？除了反转的时候加样不均，或是RNA里面有DNA污染外，还有其他什么因素会导致内参不齐？请不吝指教？谢谢

作者: 小等 时间: 2014-9-16 15:26

不同模板的CT值差1,2个，属于正常现象吧，这就为什么要做内参的意义吧

作者: jiojoo 时间: 2014-9-17 14:49

ct值15和16，其实不能算作有明显差别; H& `! W$ J) d
因为影响ct值的因素太多了# f2 y7 m$ C, r6 ?- V
不知道你测量RNA之前，有没有跑过RNA电泳，RNA中混有基因组的差异，RNA完整性的差异，反转时反转录酶反转效率的差异都会造成内参ct值的变化
反转时，为了尽量准确，是要把RNA的起启量控缺在一致的水平比较好0 L8 T2 f' Q8 ~* q1 E
不过还有一点是，GAPDH也不是说完全稳定的
给你一篇相关文献看一下吧- A% u' \, R+ _) {/ ]4 J$ B, g
http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0064786

作者: moluxingke 时间: 2014-10-18 09:44

回复小等的帖子
9 y/ h+ Z9 u& N9 f' {9 w
嗯，有道理，不过我现在都是把提取的mRNA稀释到相同的稍微比较低一点的浓度，一般500左右，这样加样导致的误差尽量减少，反转后做QRT的CT值基本一致，一般不会相差到2.大多情况下基本一致。

作者: moluxingke 时间: 2014-10-18 09:46

回复 jiojoo 的帖子
! L4 l* e' R" Y% L8 L) o2 M Y) R
谢谢帮助，现在做反转录之前，我都是把RNA的浓度调到大致差不多，情况明显有好转。

作者: zarecol 时间: 2014-12-4 15:06

再给你一点建议：平行试验用一个牌子的试剂盒

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