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2i培养mESC遇到问题
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作者:
scottist
时间:
2014-8-22 09:51
标题:
2i培养mESC遇到问题
最近在尝试用2i培养mESC，结果培养的克隆几乎没有长大，且随着时间推移（3天内），细胞飘起来的越来越多，贴壁的越来越少，不知到时什么原因？还请有经验的前辈指导一下。
作者:
genedu
时间:
2014-8-22 12:42
用2i培养的话，mES的克隆致密化程度会更高，更加立体化，所以看起来显得比较“小”，只要是铺板密度稀一点，培养时间长一点，就可以长大！用2i培养对feeder Cells的杀伤力是比较大的，所以克隆贴壁（feeder）就比较差，悬浮的变多
作者:
scottist
时间:
2014-8-22 13:15
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genedu
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' u2 z5 A) f6 s
7 f& w+ L$ o: t0 P. K0 E
非常感谢您的回复！还想请教您几个问题：如果飘起来比较多的话，是否每次换液时需将上清离心收集漂浮细胞？如果加少量的血清效果是否可以避免大量克隆漂浮？2i培养细胞周期一般要多久？也是每天都换液？我没加beta-巯基乙醇，不知道会不会对培养结果产生显著影响？能否用1-硫代甘油来代替？
作者:
genedu
时间:
2014-8-22 16:08
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scottist
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3 t# j( r* X4 I. t u6 \# }8 J
. W( @0 U" N8 `% r& B7 P! {
离心上清-消化-中和-离心-铺板；加血请也可以，好多文章都是配合KOSR，因为mES用2i培养体系就是避免血清培养的；2i培养也是一样，看细胞量的多少来换液传代；没加b-Me影响不会很大，因为一般的去氧化剂过段时间后也会失去作用，不过最好是加；1-硫代甘油没用过，不知效果如何
作者:
scottist
时间:
2014-8-22 16:35
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genedu
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0 q! S1 n- E5 l X6 b5 e9 J
2 Q7 c/ C1 n0 }
感谢您的指导，学生受益匪浅！
作者:
scottist
时间:
2014-8-25 11:31
本帖最后由 scottist 于 2014-8-25 11:42 编辑
# Z& q, j. t: f6 k: U
* N% D/ f! \6 q$ h% K* N3 C% ~
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genedu
的帖子
( e) d5 @6 S5 T5 ^0 ]2 N5 [
$ L+ B% u/ X1 y
前辈您好，我最近培养效果依然不是很好，培养第一天，克隆生在还算正常，第三天的时候，贴壁的克隆几乎很少，而且克隆也未见明显增大（见附图），请问除DMEM/F12和2i之外，是否还需要加一些B27等才能维持mESC的正常生长？不知您是否方便传一张2i培养mESC图片，学生作为阳性对照学习一下？谢谢您了！
作者:
wbj1983
时间:
2014-8-25 13:04
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scottist
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& L2 _5 S. q" O q2 G3 H/ j4 ^ [5 h
4 [8 Y1 B& {2 q6 I+ N' J
ES培养液，把血清换成N2B27再加2i,lif就行了
作者:
genedu
时间:
2014-8-25 13:50
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scottist
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- O: Z0 Q( j' A% f
: e5 t" r! L! [! \% J8 f. [; N9 X
问题出在你的培养基上，我一直在用经典的2i培养基培养，成分如下
& T. N; [; _" ?/ Y
2i Media
$ @5 `" x- O/ D5 H
For 1L, N2B27 Medium (Ying Q, Nature Biotechnology 2003)
7 d) {( B. a( c# i" p0 X
2 {/ b0 S* m% x9 w
1. 500 ml of DMEM/F12 supplemented with modified N2 (Invitrogen)
* B9 [# [: F: w7 h4 f
2. 500 ml of Neurobasal medium supplemented with B27 (Invitrogen).
- K$ n2 F) W! J0 i0 [6 O+ e4 }* O
3. Pen-Strep (final 50 units-50ug) 5 ml
6 S" U6 g$ P; ~1 h# V2 P
4. bME (final, 0.1mM) 100 ul (1M stock)
. H3 o b4 Z/ r, I
5. Lif (final, 1000 units/ml) 8 ml (1.25x 105 units/ml stock)
7 X. o# A# |7 I3 T. v
6. PD0325901 (final 1 uM) 0.5 ml (2000x stock)
/ _6 k Q4 t( n/ q5 M8 M
7. CHIR99021 (final 3 uM) 0.5 ml (2000x stock)
) Z5 f: A6 A% Q0 Z9 o$ t
8. Amphotericin B (optional) 1：100 标准计量看说明书
$ @8 c0 G6 b3 t! H" H+ ^
作者:
scottist
时间:
2014-8-25 13:59
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genedu
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3 q0 H P7 T! c Z- w% V
" u9 \: d; s$ p; v
谢谢前辈的指导！估计和我没有加N2B27有关，干细胞快速分裂需要一些营养成分，如果只有DMEMF12的话，不能够完全提供，所以干细胞基本不生长，时间长了就出现了大量的凋亡。再次感谢您的帮助！
作者:
scottist
时间:
2014-8-25 13:59
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wbj1983
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3 y5 ^+ X( t0 c
8 M: V' M; g$ R# t
明白了，谢谢！
作者:
sylar
时间:
2014-8-25 14:06
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scottist
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9 g! ]6 q2 p5 e0 u1 N7 W( z
0 N4 [( j( a/ d- \
。。。你只用DMEM+2i??? 血清呢。。
作者:
scottist
时间:
2014-8-25 14:29
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sylar
的帖子
3 [$ T$ `; |7 l9 n; y/ q6 @; M
% Z6 \' N# N( E2 T; ~1 Q
我看论坛上讨论2i的时候很多没说要加血清什么的，尽管文献中说要加N2B27，也没见大家提起，以为不加也可以，谁知道细胞就是养不起来，唉。缺乏常识啊。
作者:
genedu
时间:
2014-8-25 15:30
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scottist
的帖子
. ~! f7 | h3 y5 {: X! R
' R2 y5 E3 u: o* }
实践出真知啊
作者:
scottist
时间:
2014-8-25 17:03
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genedu
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8 O& T" ?# w: X- p* I, {" G
( E* J1 _7 g+ }1 a' l
绝对是颠簸不破的至理名言啊。
作者:
splinkerette
时间:
2015-3-3 13:50
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genedu
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+ o9 G: C1 G( \5 r/ y
1 ^( _3 k8 N! l
加血请也可以，好多文章都是配合KOSR
7 e& l- b! b. [: o4 r& s, [
' K" X8 b. e) u# T- j. ~
能不能麻烦分享下相关的文献，谢谢。。我做的完全不加血清的条件也是老长不好，加了血清觉得培养基本质上又成分不明了
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