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标题: 求助前辈们帮忙分析一下小弟实验失败的原因，不胜感激！！！ [打印本页]
作者: 2013sp    时间: 2014-8-28 23:44     标题: 求助前辈们帮忙分析一下小弟实验失败的原因，不胜感激！！！

各位前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈们帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。; j  W- a/ B/ x  |! X( |
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。2 x" s- _) M6 D" D; i' H' u
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
6 E1 R. ~6 g0 p7 j3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
  l# B) B+ n1 A0 \0 y. e+ L4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。8 ]$ q% p- n6 Y- v* s
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。  s' S3 o5 g2 u# ]$ y/ ^
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
' ~& O8 r# I6 C7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。' ?9 U6 q# E6 c5 q( F5 F
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
% W' B' R  k1 e6 j% f" |: L9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
. |% T& m4 T9 g0 a: j10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。
作者: 洛古16    时间: 2014-8-29 08:56

培养上以后，一般放置6-7天，中间不要动它，可以让它更好的贴壁。
作者: 小样    时间: 2014-8-29 09:39

我们不用酒精浸泡，取回来用加有双抗的PBS洗干净进行华通胶的分离，然后平铺在T75中就行了。
作者: backspace0017    时间: 2014-8-29 10:05

酒精泡5分钟时间过长！！20秒即可
作者: 听不到    时间: 2014-8-29 11:55

酒精浸泡那里5min太长了吧，我都不用酒精浸泡的，直接用含2%双抗的pbs洗几遍就好了，还有后来的那个0.1%双抗的pbs是怎么回事？双抗一般都是1%或者2%的吧...
作者: kakapo    时间: 2014-8-29 13:37

instead of PBS, you can put umbilical in lactate Ringer's solution. the Ringer's solution contains nutrient for cells and you get less cell death. If you worry bacteria contamination, you can use Ringer's solution containing antibiotics. Please, do wash umbilical with alcohol. to avoid bacteria contamination, you can culture cells in medium containing 2x antibiotic initially. After cells got 80% confluent, you pass cells and culture cells in medium containing 1x antibiotic. Surely, the alcohol can kill bacteria and stem both.
作者: 水念人倦    时间: 2014-8-29 13:44

根据个人的经验，我没有用酒精泡的这一过程，当然我也觉得这个可能跟最终失败结果没什么关系。9 M' J7 J6 i' ]
根据你的描述，只有3-4块贴壁，那样肯定细胞量极少，我觉得很有可能是你一开始加的培养基太多了。" y5 e: g$ J& r% W+ M9 J
在一下步骤你可以重点注意一下：: }" b9 }' w- {) Y3 z
1.块不要剪的太小，虽然各文献中的体积都比较小，但是我个人做的话用枪头直接吸都是有点费劲的，甚至有时候需要剪一下枪头；+ Y. s0 _$ ]! A
2.培养基一开始不要加太多，刚刚可以润湿平底薄薄一层就可以，然后将组织块打进去，每瓶的量可以多一些；
9 z- B2 c% J* ?' b* c, \3.另外我看了你的描述，好像没有倒置培养这一过程，一般我接到瓶子后直接倒着放箱子里养一夜，第二天观察一下再补液（因为之前说的，接种的时候培养基加的非常少）
作者: 月_幻影    时间: 2014-8-29 14:03

个人建议，不需要使用酒精浸泡这一步骤，直接使用加双抗的盐水冲洗干净脐带表面的血污即可，而且在剥离华通式胶的时候不需要加入PBS了，直接剥离即可；组织块表面水分也会导致组织块不易贴壁的；而且我们做的时候一般是铺瓶后先倒置培养，过几个小时或者第二天再补加培养基。
作者: ruofan1982    时间: 2014-8-29 14:51

接种铺瓶后先倒置培养，少量的培养基，第二天再补加培养基。组织在重力的影响下，为了克服重力，细胞会抓住培养皿，这样贴的更牢固
作者: ruofan1982    时间: 2014-8-29 14:51

接种铺瓶后先倒置培养，少量的培养基，第二天再补加培养基。组织在重力的影响下，为了克服重力，细胞会抓住培养皿，这样贴的更牢固
作者: yaolinzhang    时间: 2014-8-29 15:05

回复 2013sp 的帖子
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9 V( y$ `) _1 ^1.省去“盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min”' ]$ a/ c( ?9 i
2.建议楼主采用酶消化法收集细胞
作者: 2013sp    时间: 2014-8-29 23:22

回复 小样 的帖子6 @  K& U5 a, s4 u) Z
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有几次未用酒精浸泡，也是仅有极少的组织块有细胞爬出。
作者: 2013sp    时间: 2014-8-29 23:25

回复 听不到 的帖子. m! C9 H. v9 y4 Q$ ~
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有几次未用酒精浸泡，也是仅有极少的组织块有细胞爬出。
作者: 2013sp    时间: 2014-8-29 23:29

回复 水念人倦 的帖子
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有几次未用酒精浸泡，也是仅有极少的组织块有细胞爬出。
/ s$ {' E6 j% w( O. O  w1 L; y我一般是倒置4h后加培养基5ml.. @! q0 ?8 C% V1 W1 `) T
组织块仅有少数有细胞爬出。
作者: fuyinsheng    时间: 2014-9-1 10:33

1、乙醇消毒时间过长，可以缩短到1-3分钟
2 Z) y3 r8 n3 W/ w% h5 Y2、消毒后其实没必要始终进行抗生素处理，用正常的无菌生理盐水即可
+ A5 @+ z. A) e. `; c1 F" O. U3、脐带间充质干细胞组织块法培养时剪碎后直接用少量DF12制备成悬液接种到T75中即可，吸打前移液管可以掰掉管口这样方便吸打
作者: boyflour    时间: 2014-9-1 14:33

我认为组织块小一些更容易收获比较多的细胞，也更容易贴壁，补液或后续操作的时候不易丢失细胞，关键是接种的时候瓶中液体不要多了，只要组织块不干就好。
作者: Mandyxu    时间: 2014-9-1 14:54

操作步骤中第七步，会影响细胞的，在未将动脉和静脉剥离的时候就要充分用镊子将污血冲洗干净，以保证剥离得到的组织块不受影响；酒精浸泡这个操作我们也没有，你酌情考虑一下；铺好组织块后将静置几天再看
作者: CELL007    时间: 2014-9-1 16:04

关于你的问题：
% o" J6 f1 h0 K/ V1.       取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。 ( d0 v: x  U4 B. }' g
       浸泡于DMEM培养基中好点。: [) [' O2 p1 U
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        
, p, N/ g5 y, S# C+ |       这一步，不用浸泡5分钟，顶多1分钟就够了；其实我的建议是，不要用酒精泡，酒精泡了后只是为了好去皮，但是5分钟的话，如果你后期没有将酒精清洗干净的话，会将部分细胞杀死的，或者就出不来了。为了保险起见，还是不泡的好。我们做过对比试验的，你这还是好的，我一个同事用酒精泡后，一个细胞都没出。& }) J7 v, r+ c# |
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。  
& @  a& Q  b- a1 S% W( v' s9 A: r: c         这个大小长度，就根据自己的喜好了，怎么好处理怎么来。
; P. z5 X/ W3 i/ U0 L6 J5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。; [( ^5 e+ W) E; f- T, }
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。  
5 R6 T4 _2 o+ w. @8 I; k         组织块的间距再大一点点也可以，这样细胞才可以长开，一定要涂匀。涂匀了倒立放置1~1.5小时,然后再加完全培养基，页面刚刚泡过组织块即可。我个人感觉这一步是最关键的。一般细胞在第4到5天就爬出来了，最晚的7天也出来了。
作者: 听不到    时间: 2014-9-4 11:14

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4 F) c0 Q+ T& X% r" N9 u, q1 E" A3 D/ ~! v
那么建议你不要用酒精浸泡，然后剪的块尽量小，我都是剪到不能再小了，贴壁前培养液尽量少，不让它干就好了，然后少动它，贴壁后基本就没问题了
作者: cjsbaicai    时间: 2014-9-4 11:28

发现你制备中有以下几个问题：
' s/ S( K: a5 U5 X7 D- f% \0 B1. 酒精泡5min太长，如果用双抗的话，酒精浸泡这步可以省掉；
# [: r/ f* J$ ?- m) t' H5 d2. 未见到华通氏胶玻璃步骤，是否是去除血管后的其余部分全部来拿种瓶；" r) {4 e9 s/ r
3. 一般组织块培养10天才能见到少量干细胞，多次传代后才能获得纯度较高，数量较多细胞/ ~9 u6 t7 o# U( W: z
4. 种植密度有点偏小% x0 `1 w  d7 W' g
6. 一般T75培养瓶培养液10ml为好
作者: zhrt    时间: 2014-9-4 15:19

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, P7 h8 ?4 O2 Z8 D& B- u2 M2 F8 w( t5 N7 v# |
1.酒精浸泡时间有点长，用酒精棉擦拭下即可) Y+ q5 m# e9 {9 I$ L( N
2.用PBS冲洗干净即可
; m! P" O2 b/ {* P2 t3.可以尝试加入少量培养液进行剪碎，尽量在短时间内剪到尽量小
5 F1 ~1 l% f' \$ O0 [  E) s4.接种密度有点大
作者: 荷荷    时间: 2014-9-4 17:24

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' s7 p# T' r, K5 w( P% J) n3 K& L+ N; G2 N
1 已经用加双抗的PBS洗，就没必要再用酒精浸泡了；另外你浸泡的时间也过长，一般30s即可；
1 e/ M: h2 {8 r; A, p2 剪好后，最好用PBS洗一下，去除组织块中的透明质酸，利于贴壁；7 `" a0 d, o* M" P
3 血清浓度有些高，这样即使细胞爬出，培养的过程中也容易老化；& P8 I! G# n! N: k. \
4 培养液加的过多，T75培养瓶初次4ml培养液即可。
作者: baby00000003    时间: 2014-9-8 08:35

酒精喷一遍就够了，泡时间太久损细胞1 n7 L2 z( t4 k& f1 F8 @6 q
另外，羊膜剥掉了没？最好剥掉$ O5 Y3 x" ]& x. {$ f
平均细胞需要14天左右才能爬出来，要耐心等~' I/ F% m3 c! @7 _0 [; r
最后，试试不同品牌的培养皿或者培养瓶、换换血清~



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