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标题: 石蜡切片之免疫荧光 [打印本页]

作者: yeshch 时间: 2014-9-21 15:48 标题: 石蜡切片之免疫荧光

本帖最后由细胞海洋于 2014-9-22 08:57 编辑
( b. l' o+ \: J7 w" R1 q
请问那个前辈可以给小弟讲解一下免疫荧光的详细原理呀？尤其是加一抗、二抗的注意事项及操作细节技巧~兄弟多谢了！

作者: moluxingke 时间: 2014-9-24 08:42

这些其实有着和做western差不多的原理，首先都是利用一抗识别抗原，也就是你要检测的靶蛋白，然后用二抗结合一抗，起到一个信号放大的效果，因为二抗上带有荧光标记基团，在特定波长的激发光照射下，就发出特定波长的荧光。其中的注意事项，说多也很多，说不多也不多，主要就是保证组织不要放置太久，以免蛋白降解过度，另外抗体好用最重要，特别说明一下，如果做双标，那么一抗就用不同来源的，比如一个是兔抗，那么另外一个抗体就不要用兔抗了，以免二抗不能特异识别，并且二抗的荧光标记也不能一样。知道大致原理之后先试做一遍，就有个大致的概念了，反正很多细节问题都是在实践中发现的。祝你顺利

作者: yeshch 时间: 2014-9-24 10:03

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b" J8 D8 R6 m6 o5 D+ o
OK，thanks！

作者: jieniao1 时间: 2014-9-24 14:42

我给你我做的一个protocol吧，一抗是不同源，还有前期根据抗体的要求做不同的处理就行了。5 ?. y, T" R) v; n
Double immunofluorescence for CNPase and GFAP on fixed paraffin-embedded tissue sections.4 @3 o2 i, W% j# {0 E% C9 M3 ^5 U' s
1. Deparaffinization (2×3 min, Roticlear; 1×3 min, isopropanol; 1×3 min, 96% ethanol).
2. Incubate tissues in 0.5% H2O2 solution, 30 min, RT (inactivation of endogenous peroxidase).: L3 `0 Y5 \. ~$ d) ^+ @( F H
3. Rinse tissue with PBS, 1×5 min.6 ~0 X- h: f h+ n; i) J
4. Boil tissue in citrate buffer in microwave pretreatment, 20 min (antigen demasking)./ i2 M) x1 f. H0 G- y' s' L" I
5. Rinse tissue with PBS, 3×3 min.& @5 M/ ^5 w: j* D+ Z% z& Y
6. Incubate tissue in 20% goat serum, 30 min, (blocking of unspecific antigens).# H& g4 h) S& h! W3 A
7. Incubate tissue with both primary antibodies (CNPase, mouse, 1 : 100; GFAP, rabbit, 1 : 1000), 1 h.
8. Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
9. Incubate tissue with both secondary antibodies (goat anti-rabbit Cy2, 1 : 200, goat anti-mouse Cy3, 1 : 200), 1 h, RT.
10. Rinse tissue with PBS, 3×3 min., Z& p- k' i# L, y
11. Incubate cells with bisbenzimide solution, 10 min, RT.
12. Rinse tissue with PBS, 3×3 min.
13. Rinse tissue with distilled water, 1×5 min.) _7 i# T( D2 t5 R" a4 A! j
14. Mount slide with Roti ®-Histokitt II mounting medium.0 S5 D- u0 ~$ [, ]- @

作者: yeshch 时间: 2014-9-25 13:23

回复 jieniao1 的帖子 L0 s Z" h6 }- Y. b! i4 C
# g: Q" c7 p" U1 }! P
thanks a lot!i will make an attempt.

作者: yeshch 时间: 2014-9-26 11:00

回复 moluxingke 的帖子" ^& t' \0 @4 q( l; Y# @5 _
2 ?, Z( n6 I$ e$ P
切片的时候，切出来的蜡条褶皱很严重，而且经常展不开是怎么回事？还有就是材料很容易就跟周围的蜡分离，甚至材料在展片后总是有空洞。还望多指教!

作者: moluxingke 时间: 2014-9-26 16:58

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蜡片起皱一个原因是刀片钝化。建议及时更换新刀片，另外，有时候全新的刀片也会出现类似现象，这个时候需要将蜡块在冰上预冷一下，然后切片。时不时的用口对着蜡块哈气，这样切出来的片子就没有那么皱，展片时，在载玻片上滴加几滴70%酒精，然后将切好的切片放上去，再转到水槽里面，利用酒精张力，利于展片。展片水温可以适当提高一些。
关于第二个问题，主要是你包埋的时候组织过冷，和周围的蜡没有很好的融合，所以包埋要快，在没有包埋之前，组织最好浸在融化的石蜡里面。意见仅供参考，也可能还有其他原因，逐个排除吧。

作者: yeshch 时间: 2014-9-27 09:12

回复 moluxingke 的帖子* ]7 D* ~7 u" b

非常感谢你的指导

，我再试试看

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