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标题: 关于WB制胶的问题 [打印本页]

作者: shaozi402 时间: 2014-10-10 16:37 标题: 关于WB制胶的问题

我刚开始做WB，查了一些相关资料，发现在制胶的过程中有一些问题：1 c# O3 g+ k: T8 D0 I* X- G" p
分子克隆实验指导书上显示为：水，30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/L Tris (PH8.8)，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED,1 w* E* k" x. t. B& e4 n3 _
可是在beyotime的凝胶配制试剂盒上却显示为水，30%丙烯酰胺溶液，1mol/L Tris (PH8.8)，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED, r( H( |( E+ |5 e& f# t0 E
为什么Tris的浓度不一致呢( r' t0 a1 R6 z
请教各位老师7 e) m( z1 u" Z0 e. e

作者: qingxingruyu 时间: 2014-10-11 12:17

不分浓缩胶和分离胶吗，应该都可以吧，而且试剂盒我觉得是优化后的

作者: shaozi402 时间: 2014-10-11 12:56

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我写的这个是分离胶8 j- }) _0 t. q5 b3 ?

作者: moluxingke 时间: 2014-10-11 19:56

一般实验室自己做胶，分离胶用的是1.5M的Tris。看8.8的PH应该是做分离胶用的，对western制胶来说，PH值是很重要的，浓度可能要求没有那么严格，试剂盒应该是一套优化后的体系，应该没有什么大问题。

作者: shaozi402 时间: 2014-10-12 16:19

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哦，我明白，谢谢

作者: yinchong42 时间: 2014-10-12 23:40

很多时候，一些试剂用量需要灵活控制的实验，在掌握操作的同时也要弄清楚各个组分是干什么的，比如SDS-PAGE，水的作用是稀释，tris作用是调节PH和凝胶渗透压，蔗糖的作用是增大凝胶密度以免上样蛋白沉落，SDS的作用是变性蛋白，丙烯酰胺过硫酸铵的作用是构成凝胶，temed是催化；在了解了各种成分的作用之后，就可以自己设计实验方案，

个人建议做western配胶尽量自己配，试剂盒和买来现成的胶大多不如自己配的靠谱

作者: shaozi402 时间: 2014-10-13 14:19

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谢谢您，虽然只有三行字，但是句句都中要害。

作者: yinchong42 时间: 2014-10-15 00:12

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不客气，相互学习！

作者: 97b1 时间: 2014-10-15 18:25

这个按照分子克隆的来就行了，或者abcam的指南

作者: shaozi402 时间: 2014-10-19 16:30

回复 97b1 的帖子
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好的，谢谢; z8 t9 O+ y" q0 d* }; Q3 z7 @5 W

作者: 生命之轻 时间: 2014-10-20 18:56

我觉得你这里虽然分子克隆是1.5mol/L Tris (PH8.8) 试剂盒是1mol/L Tris (PH8.8)，但由于分子克隆还加了水稀释了，它们最后Tris的浓度应该是一样的。

作者: shaozi402 时间: 2014-10-21 08:11

回复生命之轻的帖子5 `# a$ {2 d8 @8 p( S
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是要加水，加水之后Trish的浓度是稀释了，但是其他成分的浓度应该也被稀释了吧，

作者: shaozi402 时间: 2014-10-21 08:11

回复生命之轻的帖子7 ?# ?9 r" L8 e- {8 M* m9 p

是要加水，加水之后Trish的浓度是稀释了，但是其他成分的浓度应该也被稀释了吧，

作者: 晴斗斗 时间: 2014-10-29 11:12

配方中Tris-Hcl的作用：* B$ r0 o$ n- [) j. V
上层的浓缩胶用的是Tris-HCL缓冲液，PH6.8，HCL的解离度大，几乎全部成CL-，CL-在电场中移动最快。而电泳槽中含有甘氨酸，在PH6.8时只有少量解离，在电场中移动的最慢。蛋白质（被夹在中间）就在由快慢离子形成的电位梯度中被浓缩了。下层的分离胶用的是Tris-Hcl缓冲液，PH8.8，在此PH下，甘氨酸解离度增大，泳动速度增加并超过了蛋白质，原先的电位梯度消失，大小形状不同的蛋白质在电场中分离。

作者: shaozi402 时间: 2014-10-30 15:34

明白了分离胶和浓缩胶的本质区别，谢谢！0 b1 P- a' }: O* M$ d H- L

作者: 妖妖空 时间: 2014-11-3 14:58

实验室应该有一个配胶的表吧，里面写了各种体积中各种组分的体积嘛，这些细节就不要纠结了。不过对于WB来说，配胶和转膜是最重要的操作，基本上决定了你最后的结果的好坏。这个多体会体会，有些人都做到博士毕业了。WB跑胶还是压不齐。

作者: shaozi402 时间: 2014-11-3 15:09

回复妖妖空的帖子* ?; L3 X" e8 c5 J; Y+ b

谢谢了

作者: thetenstar 时间: 2014-11-4 02:22

Tris的浓度不是最重要的，PH最重要！现在一般都是1.5的，也有少部分1.0的，你用那种就用那种的配方就好了！一般没什么问题！

作者: shaozi402 时间: 2014-11-4 16:39

回复 thetenstar 的帖子3 {; }3 T6 ~9 {2 Z+ _- `( K/ a

好的，谢谢* L6 D% t4 ~4 m& V; [) v3 [4 J

作者: naturehu 时间: 2015-1-5 20:40

tris的主要作用是稳定pH和渗透压调节，虽然浓度不一样但是可能不同浓度tris的添加量也有差别吧。

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