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标题: western 检测的蛋白表达量太少怎么办 [打印本页]

作者: hyde 时间: 2014-11-6 21:17 标题: western 检测的蛋白表达量太少怎么办

要用抗体检测细胞上的蛋白，做了流式，虽然处理组和对照组的表达量在流式上可以看出差别，但是做western表达量还是太低，没看到条带（是细胞表面的膜蛋白），？有没有什么方法富集呢？除了western 做免疫组化可以替代吗？

作者: qingxingruyu 时间: 2014-11-7 08:27

做WB看表达差异，尤其是都表达量低的话太难做了，免疫组化有看到这样做的，但感觉说服力不如WB

作者: 懵懂干细胞 时间: 2014-11-7 08:30

膜蛋白的话可以做免疫荧光试试，如果在WB方法富集的话，可以考虑以下几方面：1、millipore的过滤柱，但是效果不稳定； 2、增加上样量； 3、使用信号增强试剂盒； 4、优化其它条件！！！: O9 k! F' m0 L# B
祝顺利！

作者: moluxingke 时间: 2014-11-7 08:41

干细胞的建议很好，你如果要定量的话，还是要用WB，免疫组化主要是用来定位的，不过你可以用来试试看是否有表达。另外你收集蛋白的时候，可以专门收集膜蛋白，这样使你的目的蛋白相对量就高一些了，推荐你显影的时候使用超敏显色底物。

作者: 食毕莫饥 时间: 2014-11-7 13:48

唉，细胞的话最好还是增加样本量吧

作者: yinchong42 时间: 2014-11-10 15:19

不知道你指的没条带是条带位置不对还是目标位置上拖带还是白板？
膜蛋白确实不太好跑，所以你们是用什么裂解液提的蛋白？看看有没有超量表达该蛋白的细胞，试试，如果没有的话就提取相应的组织蛋白试试（当然如果有纯蛋白就更好了）；
还有就是不知你们的wb检测体系是ccd直接检测还是ecl，如果是后者的话可以试试超敏发光底物，不过个人用不惯9 L$ s! l5 B; G3 q5 X) A
还有就是把封闭剂换成BSA再试试，

作者: yuanyecat 时间: 2014-11-12 10:24

如果你熟悉流式原理，明白流式只能看到检测部分的情况不能说明你的所有样品细胞的情况，可能只有10%很强，其他很弱，0 z7 I* l' c( f1 n5 i! d- n
我的建议是：" i; i% k( j) Q [& m7 `
1.首先看看抗体的特异性是不是很高，你有阳性对照吗？* ?, I; X% q6 l( h; c1 \4 n
2.再者，如果不是特意性问题，可以用专业的试剂盒浓缩蛋白看看。
3.还有最后显色的时候，可以用超强显色的试剂盒，如超敏型辣根过氧化氢酶DAB 显色试剂盒

作者: ceshishua 时间: 2014-11-14 12:01

一般来说western 时，总蛋白的浓度控制在1~3mg/ml，这个可以用标准蛋白加酶标仪来测。: ?& a% `$ `5 i5 {) Q$ j
1~3mg/ml的体积是长期摸索的结果，大部分时候都是没问题的，除了少数表达量很少的目的蛋白，比如受体蛋白。另外这个浓度范围也可以保证胶孔中的样品加的不至于太满。: @8 o# |3 N% m; q9 g8 F6 D# a
如果只是定性的看，也建议这样摸索一下蛋白浓度。这样一来，根据目的蛋白的表达情况去确定上样量、控制上样体积等方面都会方便一些。

作者: hyde 时间: 2014-11-16 16:24

谢谢，我先试试增加浓度看看

作者: yinchong42 时间: 2014-11-17 16:08

回复 yuanyecat 的帖子

很多人都说用超敏，但是个人使用超敏的背景太深，不知你们是用的CCD还是胶片直接显色？

作者: 妖妖空 时间: 2014-11-19 23:59

抗体本身没什么问题吧，外源和内源的检测都做了吧，有阳性对照嘛。这些都没问题的话，可以使用超敏看看，有marker的情况下你把你要的那段切下来去压片就好了，我也做过膜蛋白也遇到过这种情况，超敏后效果还可以。

作者: daviddow 时间: 2014-11-25 08:54

使用超敏ECL发光液试试

作者: tiramisu 时间: 2014-11-25 09:59

之前我也有蛋白表达低的时候，后来转膜的条件改善之后就好了。除了转膜之外，还可以查看下一抗的特异性，二抗的来源，以及增加上样量。

作者: 妖妖空 时间: 2014-12-14 12:32

不知道你的问题解决没有，我最近也正好检测一个以前做的抗体。我的目的蛋白220KD的大蛋白，第一次检查没压出来，因为这个蛋白表达就很低，第二次的话，我100V转膜，转了3个小时，然后可以看到不是很强的条带了。昨天换了一种处理蛋白的方法。然后效果就很棒了。你可以用提取RNA的方法分离得到蛋白，就是用trizol得到蛋白，然后再用2×的loading buffer煮，因为想起来看到过这样一个帖子，所以回复下，希望可以帮到你。

作者: daviddow 时间: 2014-12-16 10:36

1：裂解的时候时间加长，冰上1个小时/ X" g* ?( \2 [8 i
2：机械裂解7 h! n. U a& K2 N! b
3：加大一抗的浓度
4：一抗二抗孵育时间
5：用thermol ECL 超敏发光液

作者: naturehu 时间: 2014-12-31 20:01

本帖最后由 naturehu 于 2014-12-31 20:01 编辑   |, a' k" ]! w' i& t' M
" J  Y8 r  @0 i$ D
1、个人认为可以用阳性对照试试体系有没有问题3 Y) v  b3 v3 i+ @& m
2、考虑提高样品浓度试试9 B) U2 w* X9 x; I4 z
3、测定蛋白含量后猛的增加上样量，先把条带做出来，确定体系没有问题了再考虑变异系数等其他问题。

作者: realyy10 时间: 2015-1-6 11:10

回复 yinchong42 的帖子4 {& u" W( y# j9 Y6 o8 Q- n/ T

我们用的CCD的貌似比较灵敏，但是最终条带也不算太深，时间长了就背景高，不如胶片的效果。你用的啥底物

作者: yuanyecat 时间: 2015-1-6 15:04

如果你想用富集，蛋白富集有很多种方式，) E: ~6 _4 p7 z- Z0 D6 k4 p& I
1，购买富集试剂盒，如life tech或者biorad，
2，冷冻干燥细胞提取液，
3，用层析柱的方法

作者: yuanyecat 时间: 2015-1-6 15:05

但是有时，我不推荐富集的方式，富集会使蛋白变性，你可以用超敏的显影剂，这样可以检测到微量蛋白

作者: yinchong42 时间: 2015-1-18 01:56

回复 realyy10 的帖子
6 c/ [8 j. o4 A- y
我用的thermo的底物，超敏的底物背景太高了不敢用……

作者: seandsa 时间: 2015-1-23 09:17

我以前也做过一个蛋白，表达很低，realtime时Ct将近29了。用RIPA裂解液怎么也检测不到，后来就像14L一样，用trizol提取，再等体积2*loading buffer煮，封闭用BSA，就检测到了。

作者: liuyasi2008 时间: 2015-2-1 18:52

做WB的话，可以用6Xbuffer，上样量提高到20ul，一抗浓度提高，一抗过夜，第二天可以复温30min，延长曝光时间。我们这边哺乳昆虫表达蛋白在小量表达的时候（主要是本身表达量就很低，只能WB检测，跑蛋白胶没有条带）都这么检测，不过用的是标签抗体。

作者: splinkerette 时间: 2015-3-4 11:04

几个方面吧：开始就把细胞量尽量增多些，点样时样品量上多点；一抗可以减少奶粉的浓度，虽然会背景会增高，但信号也会明显增强；超敏发光底物也是很有必要的，我们实验室用的胶片曝光，感觉比CCD灵敏且噪音少

作者: 周小木 时间: 2015-3-12 18:38

加重上样量的+1

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