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标题: 求助，有做过羊膜上皮细胞的大神吗？求帮忙 [打印本页]
作者: 听不到    时间: 2014-11-21 15:37     标题: 求助，有做过羊膜上皮细胞的大神吗？求帮忙

我是取得羊膜之后，分为两半，对之用PBS（双抗）进行洗涤，然后用0.05%的胰酶-EDTA消化20min（37°水浴），共消化了2次，终止后用250目筛，然后离心重悬，当时取得的细胞挺多的，种于两个10cm平皿中，但是48h后我换液后发现贴壁细胞非常少，而且形态各异，想请问下大家大概哪种细胞是羊膜上皮细胞啊？还有我操作的有哪里不对导致细胞量这么少呢?- b: E% y, W5 p8 ?
这是我种了两天之后的细胞（换液前)
5 K, p3 z9 o3 U QQ截图20141121152243.jpg QQ截图20141121152222.jpg & m$ U- n- @7 }6 ], d$ C
这是种了4天之后的细胞
4 n# T2 f. g. [# Y( y6 C1 q QQ截图20141121153453.jpg QQ截图20141121153442.jpg ) |$ d, Y, M  b2 V9 M


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作者: frankhu    时间: 2014-11-21 16:04

根据图片看，这次试验可以宣告失败了，羊膜上皮细胞应该成铺路石状，而且为了得到更好的纯度，一般接种密度尽量大，一般24小时贴满效果比较好。
作者: 听不到    时间: 2014-11-21 16:14

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% q4 @" I# ]7 g( S' S) ~% d: w; }: i7 {1 y2 _( l5 u6 }- V( y  q
那我操作的步骤是哪里不对吗？我初步想的是可能是我拿到之后去血去的不干净，但是我只是在PBS里洗的话洗不下去，然后我用镊子打算捏下来的时候就感觉是撕下了一层膜，我就不敢撕了。其次就是我消化的次数太少，我消化了2次，打算再做的话消化4次，不知道这样改进行不行。但是去血这边我还是不太确定
作者: frankhu    时间: 2014-11-21 16:59

你先保证羊膜是新鲜的，方法有好多种，图片上看效果很不理想，感觉消化下来的都是死细胞
作者: 听不到    时间: 2014-11-21 17:20

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2 q  g4 t0 f, U/ |3 h
' ~7 H3 Y; E, j3 K8 R: `. b: z2 X羊膜算是新鲜的吧，我是从医院拿到后约1h放入4°的，然后又过了2h后开始做的，那是我在用PBS洗的时候应该再彻底些吗？我实在不知道应该咋整了...
作者: frankhu    时间: 2014-11-23 09:07

再做几次试试，羊膜上皮细胞本身就不好分离
作者: 听不到    时间: 2014-11-23 09:49

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$ o) J& H, O; n0 y& z6 W3 ?  ?. k0 r5 \0 m- K9 L/ k& s* {; h
羊膜不好整啊，不咋敢试，那你看我图中有像羊膜上皮细胞的吗？我老觉得有间充质呢
作者: yaoguanping    时间: 2014-11-23 12:27

那些都不是羊膜上皮细胞，实验需要重做，具体是你的上皮都没有消化下来，上皮应该是铺路石状。
作者: 听不到    时间: 2014-11-23 12:54

回复 yaoguanping 的帖子6 S1 B% s" q9 W0 B

( \  W( f. R. I5 g: ^; S, [那是由于我最初没把上面的血清下来的原因吗？我消化了挺长时间的啊，怎么会没消化下来呢
作者: frankhu    时间: 2014-11-24 09:05

回复 听不到 的帖子4 f, x! r+ ?% Q8 Z5 u& M

# E& x# R* ^+ t$ M羊膜一定要充分洗净，你可以试着放到摇床里孵育消化，消化后再过筛。
作者: 听不到    时间: 2014-11-24 09:19

回复 frankhu 的帖子' j& p2 ~+ q# ^* X0 a/ a; u5 H- S+ }6 b
3 W5 B" j! n* j- D' K) ?- _
那是把肉眼可见的血丝之类的全部都洗掉吗？基本上我试了试，只能用镊子往下撕，但是一撕就撕掉了一层，我怕撕掉的是羊膜，本来细胞就少，还撕掉一些。还有就是，我怀疑我是不是不能48h换液啊？有点早？48h半量换液，72h再全量换液？
作者: frankhu    时间: 2014-11-24 09:39

回复 听不到 的帖子  m4 F: ]6 ]& H% N

" t" b5 N" G' \/ _换液时间不是关键，羊膜上皮细胞几个小时就能贴壁。正常情况下，刚分离的羊膜上皮细胞中会夹杂大量的间充质细胞，但是图片中也没看到。最好做之前多查阅几篇文献，然后再做几次，反复总结。想一次就成功分离羊膜上皮细胞，对技术本身要求还是太高了。还有确定培养体系是没问题的。
作者: 听不到    时间: 2014-11-24 09:48

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7 o3 S. x- Z+ ]: {' }, @( N9 Y7 ^( ?4 m- z9 ^2 a
培养体系的话，我看的很多人用的是DMEM/F12+10%FBS+10ng/ml EGF，不知道行不行，我现在用的是一个乳腺上皮细胞培养液，但是我查到说有个胎盘上皮细胞培养基，貌似更适合...完全不知道应该用啥
作者: frankhu    时间: 2014-11-24 10:00

回复 听不到 的帖子/ p) m  _# O; C
! p0 X) A% k, H, W: E3 P6 _) c
你就选一种认为比较靠谱的试一下
作者: fuyinsheng    时间: 2014-11-24 10:24

0.05%胰酶对羊膜的消化效果不好，及时长时间消化也没有太好的效率，及时消化下来了由于胰酶处理时间太长也导致贴壁率低，建议用0.25%的胰酶试试
作者: 听不到    时间: 2014-11-24 10:59

回复 fuyinsheng 的帖子4 M9 c. g+ M, ^) W% W; V
! m7 Y  a% K2 s; D, O; H3 z; q+ c
我查的大部分文献都是0.05%的胰酶...0.25%的话大概消化多长时间呢？主要是羊膜不好整，然后就不怎么敢试
作者: 听不到    时间: 2014-11-24 11:00

回复 frankhu 的帖子$ b$ {. u! I# q, n2 h' Y2 D

# v8 o. `+ A# S9 a你做过这个么？用的是啥培养液啊？
作者: frankhu    时间: 2014-11-24 11:12

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- ?( _3 u+ F: }! e
; E7 c, H9 h( M: L' K  h4 c做过，DMEM+非必需氨基酸+EGF+10%胎牛血清
作者: frankhu    时间: 2014-11-24 11:13

回复 听不到 的帖子. l; c! w/ W4 T2 R) J$ _4 H

. @( X' ~* t. U3 H+ O, ]做过，DMEM+非必需氨基酸+EGF+10%胎牛血清
作者: 听不到    时间: 2014-11-24 12:49

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* f! Y8 v! M# k8 e* |  m; @( D- _
3 k5 |, N) g! i好的，谢谢哈~赶脚我接下来就是注重去净血，还有多消化几次就好了。我再试试啦~
作者: sc-cxw    时间: 2014-11-26 16:31

战友，你撕下来的是哪一层呀？
作者: 听不到    时间: 2014-11-27 11:08

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# v6 [1 O* {/ e
5 i4 g; t$ F( i! Q4 l* W& l& @我也不知道...就是把血丝撕下来的时候感觉也撕掉了一层什么东西...
作者: sc-cxw    时间: 2014-11-27 15:42

回复 听不到 的帖子8 {  u- l; t" R

/ D7 a, H- e/ l0 d( f5 R根据定义来看感觉羊膜是那层透明的无血管的薄膜，可是我消化过那层，根本没细胞。
作者: 听不到    时间: 2014-11-28 11:06

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& J. ~$ E% L* u0 S0 s. Q: B( P. `: s, A
我昨天听人说应该是处理干净之后是完全无血的白色的薄膜
作者: sc-cxw    时间: 2014-12-8 10:24

回复 听不到 的帖子4 d* ?. y" _7 ^
0 z! O+ G' c& @$ x* ?; q
我处理过，感觉没有想要的细胞，你试一下结果如何？
作者: coffee.cat105    时间: 2014-12-8 11:36

回复 sc-cxw 的帖子6 J# v2 {% q, R2 }$ H+ d7 J" D

& K! U  I" y3 \& `我也是试了半年，从来没有过1个细胞，一个都没有，可是人家都说是这一层，搞不定啊
作者: 听不到    时间: 2014-12-9 19:40

回复 sc-cxw 的帖子4 u- W' W+ H# T( Z+ H6 w* {& a1 D
- ~5 b  E4 M6 u, [+ Y6 e' R
我试了一下，倒是贴壁了，但是明显贴壁的不是细胞，不知道是什么东西
作者: 听不到    时间: 2014-12-9 19:43

回复 coffee.cat105 的帖子# `4 R! m. F9 |+ e! ~1 M

; r# q4 k2 R: }: O- N啊？你这样一弄我一点信心都没了，我上次处理到最后就是超级薄的一层膜，透明的了，也消化下来了细胞，但是可能是我取到的羊膜已经结冰...的原因，还有我处理的时候已经拿到羊膜很长时间了，所以以为这些原因导致细胞死了，打算再试试的。我隔天看的时候发现贴壁了东西，但不知道是什么，明显不是细胞。初步认为是细胞碎片。打算明天再试试的，你这样一说我都不敢整了...
作者: sc-cxw    时间: 2014-12-10 13:45

回复 coffee.cat105 的帖子1 O  G. E) M; ~$ T, c4 u* u

) b* E1 H9 `( e8 ^, W( X# s我一开始也特别执着于那层，现在无比怀疑~
作者: coffee.cat105    时间: 2014-12-11 12:41

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# I( v( ]$ d, o3 S8 g- R# H$ u+ s1 }- [- D- u0 z. D" t
试试吧，我建议你各个部位都试试…………; l# X+ n" Q3 a" C, t; F/ w
作者: 帝国黑骑士    时间: 2014-12-11 17:14

羊膜是包裹胎儿的那一面，是一层薄而透明的膜，和它连着的是绒毛膜，应该没撕错吧，很好洗的，建议用0.25%的胰酶，适当用剪刀剪剪消化更充分，基本上第二次消化的细胞会多一些，你在试试摸索摸索！
作者: coffee.cat105    时间: 2014-12-15 16:37

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. |( C) `8 k  b0 V$ K
: O- j$ f0 l+ V/ Q我每次处理羊膜都能搞出四五层来，胎儿面最外面那一层也消化过，没有细胞啊，贴着绒毛膜的的那一层倒是能有细胞，但是细胞不多，贴壁也很少，是我撕错了吗？
作者: 听不到    时间: 2014-12-16 11:13

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# ^2 A) x4 p* I0 P, \; X  _/ s$ |2 Q0 J+ P# v9 c
没权限在留言板上回复  b* `' x- W. f: ?1 B
我成功贴壁了，但是成功的莫名其妙，我觉得是不是偶然那种...我是撕下带血丝的那层后用盖玻片轻轻刮了羊膜，刮下了一些粘液，不敢用力刮。然后0.05%胰酶37度水浴10min后过滤离心种瓶，剩下的再消化40min后过滤离心种瓶，最后是40min这个贴壁了。但我不知道能不能重复出来，所以最近打算再做一次
作者: coffee.cat105    时间: 2014-12-16 11:18

本帖最后由 coffee.cat105 于 2014-12-16 11:21 编辑 2 \- |3 ]3 p% C5 h1 H/ O( U
1 n5 C9 w: Q9 ^! t" p  B) ~
回复 听不到 的帖子
& t" O" u6 p$ }; p5 o7 F4 X0 n: |) q4 q+ O  G+ V
贴壁的细胞量大吗？我每次都能有些皮样的细胞有些间充质样的细胞，但是上皮样的细胞每次都不长
) W( ]2 K. ^9 m4 j) }! Y0 C: ~5 ?0 ^/ }5 U) K
您是做的胎盘上的还是胎盘周围的？我感觉您的描述像胎盘周围的呢？
作者: 听不到    时间: 2014-12-16 11:21

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( w" [1 I4 V/ f3 p' s; c2 H" s2 e" V5 m9 b2 T
挺多的，我处理后第三天看的，基本就可以传代了那种，上皮样细胞比较多，有少量间充质样细胞，然后我现在传到了F1代，感觉明显间充质样细胞变多了，不知道培养液能不能起到选择的作用
作者: 听不到    时间: 2014-12-16 11:22

回复 coffee.cat105 的帖子7 c" ^% d  p# _4 S2 H. m  b* Z

$ u* c) o0 o, @5 g+ f& k* p我觉得我这次之所以能长出来也有部分原因是我取羊膜的时候是让他泡在双抗PBS里的，然后就没结冰...实在是我上次直接放在冰盒里拿回来，然后完全结冰了就，估计细胞都冻死了
作者: coffee.cat105    时间: 2014-12-16 11:27

回复 听不到 的帖子3 q. Y7 Z: z% \2 ?
- b6 n, K7 ~) m/ O2 U* n
您取的羊膜是哪一部分？能描述一下吗？我是取的胎盘边上的部分，拿到后撕掉胎儿面的最外层和有血那一面的最外层，这样就能有细胞，但是贴壁很少，也很不长，我一直觉得我取材不对，是不是这个原因啊？3 T) M5 e4 J7 O
作者: 听不到    时间: 2014-12-16 12:26

回复 coffee.cat105 的帖子5 c. R# G/ E4 _# `7 T5 o$ \
+ ]+ W; g  K3 d. I+ |
我不知道...我不是临床的，是找的医生要的羊膜，他直接给我的，所以我也不知道取得是哪部分
* f" S- d3 E/ v
作者: 听不到    时间: 2014-12-16 12:29

回复 coffee.cat105 的帖子& `8 u" L. h& u0 e5 h9 ^
7 w# [: b4 ^+ }
我拿到的挺大一部分，所以我理解的是拿的是胎盘上的，具体的我也不是很清楚，不过我是只撕下了有血的那层，我理解的是另外一面最外层就是羊膜了，羊膜上皮层不是在最外面吗？
作者: coffee.cat105    时间: 2014-12-16 13:16

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3 y3 k' W! g& _' A. B
哦，那你有没有用胶原铺板？
作者: 听不到    时间: 2014-12-16 14:23

回复 coffee.cat105 的帖子% x! ^# P9 E& w  M3 Z
' |, D" s9 W& G8 G1 m
没有，就正常种瓶的
作者: chelran    时间: 2015-1-4 17:08

你这个事消化的问题，如果你觉得有血细胞，你可以在胰酶消化之前，用EDTA先抚育10min，37度，用PBS 洗两遍，把血细胞去除
8 D3 r4 h; u% ?# m1 d6 K! |1 j
作者: 听不到    时间: 2015-1-6 09:36

回复 chelran 的帖子- ^3 N* W) Y4 f/ a6 z4 S
7 i  Z5 L  C5 |( r' X  E# J5 k0 B
原理是什么啊？我没有查到...
作者: lju00    时间: 2015-1-14 10:14

我看到你的间充质干细胞倒是有几个
作者: yanxm920    时间: 2017-12-18 11:05

回复 听不到 的帖子' ^5 c0 t0 q9 t- Q, |& A

" Q; i% P; N- c& J7 R3 Z老师这个培养体系DMEM/F12+10%FBS+10ng/ml EGF，有参考文献吗？



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