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标题: 求助，原代分离羊膜上皮细胞不贴壁 [打印本页]

作者: 听不到 时间: 2014-12-2 20:20 标题: 求助，原代分离羊膜上皮细胞不贴壁

求助！！！我原代分离的羊膜上皮细胞，镜下能看到很多细胞，可是！！！他死活不贴壁！！！过了3天了还不贴！！愁死了，我分离了好几次了，细胞现在能消化下很多，但是就是不贴壁，我培养液是加了10%血清的，求做过的前辈帮分析下原因。% t0 [& [, Q! U* |! g
我的protocol是：洗净羊膜后，于0.05%胰酶37度水浴消化10min后弃消化液，再用0.25%的胰酶37度水浴消化20min后，离心收集，过滤。重复消化3次后种瓶培养。也试了用0.05%的胰酶37度水浴消化20min后，离心收集，过滤。重复消化3次后种瓶培养。都能得到很多细胞，但是也都不贴壁...求助！！！( Z9 ]( _9 t9 ?5 m" H+ F% Y

作者: qiaozhong.9876 时间: 2014-12-2 21:59

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我想问一下你的是胎盘羊膜上皮细胞还是什么？你试试培养基里加20%的血清，不知道你的培养基里有没有加因子，这个很重要，我觉得你重复消化，细胞有可能死了，细胞死了也不贴壁，你做个胎盘蓝染色，看看细胞死的多不多，还有一个原因就是这个羊膜本身的问题，有的羊膜上的细胞就是不贴壁

作者: 听不到 时间: 2014-12-3 09:36

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是羊膜上皮细胞，加了因子的，10ng/ml的EGF，是因为重复消化的原因吗？可是消化时间短的话我怕得到的细胞太少啊，那样不是也不能贴壁吗？我查的文献基本都是消化20min什么的，我就整个那样做，但是细胞也不行。应该不是羊膜的问题，因为我做了两次了都不行，而且是同一个问题，就是细胞很多，但不贴壁。我现在思考是不是我培养液的问题，你之前做过吗？培养体系是什么样的啊？
之前问了个老师，他也猜我这是消化过度的问题，我之前都没做台盼蓝染色的，下次做的时候再试试吧。唉，愁死了

作者: 听不到 时间: 2014-12-3 14:45

而且我查到说胶原酶对上皮细胞的分离更好，但是我看大家做的好像都是胰酶消化时得到的羊膜间充质细胞比较少，加了胶原酶之后就会得到的羊膜间充质细胞比较多，难以得到比较纯的羊膜上皮细胞，所以想知道有人用胶原酶消化羊膜得羊膜上皮细胞的吗？

作者: 一转身的距离 时间: 2014-12-3 16:25

个人觉得你的消化下手太重，0.25%的酶浓度太高了吧？另外消化时间太长对细胞的贴壁能力会有直接的影响。

作者: yuanyecat 时间: 2014-12-3 16:51

胰酶太厉害了，第一次可以用胰酶，但是第二次消化用不那么厉害的试一下，例如actutase。还有检查一下培养基是不是有问题

作者: fancys1028 时间: 2014-12-3 20:15

胶原酶消化的话得到的是间充质啊做原代一般我们都用的是含0.02%EDTA的0.05% 胰酶

作者: qiaozhong.9876 时间: 2014-12-3 21:08

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我现在一直在做胎盘羊膜上皮细胞的分离与培养，我分离的细胞基本上很少有不贴壁的，我一般胰酶消化10分钟后去掉再加胰酶消化一个小时，没有重复消化，在消化半个小时后摇一摇继续消化，我觉得是你的培养基和因子的问题，不知道你用的是什么牌子的培养基和血清，血清最重要

作者: 听不到 时间: 2014-12-4 12:21

回复一转身的距离的帖子" n7 a" [6 m8 [) X4 D) y

我试了0.05%的胰酶，与0.25%的胰酶操作步骤相同，但是都不贴壁

作者: 听不到 时间: 2014-12-4 12:24

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你这样不会消化时间太长了吗？我现在就是怀疑是消化时间太长导致细胞不贴壁的...而且初始你去血之后的羊膜是不是有点发白的那种很薄的膜？我怕消化10min后弃掉的消化液里有大量上皮细胞啊...我用的培养液是promo cell的一个培养基，基本不能有问题。血清是gibco的，也不能有问题

作者: 听不到 时间: 2014-12-4 12:25

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那你们消化步骤是如何呢？重复消化吗？我怕我消化时间太长

作者: alicia_86 时间: 2014-12-5 08:47

我们用胶原酶消化的，个人也同意楼上说你培养基的问题。。

作者: 听不到 时间: 2014-12-5 09:54

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胶原酶消化下来的不是大部分是间充质吗？培养基应该没什么问题，像EGF，血清这类必需的培养基里都含有了

作者: coffee.cat105 时间: 2014-12-8 12:42

回复 qiaozhong.9876 的帖子$ P, O5 `% ^6 B7 i, J; w

请问能不能描述一下您消化的是哪个部分的细胞，我揭了胎儿面那一侧的薄薄的很有韧性的部分消化，从来没有消化下任何一个细胞下来，间充质都没有，一直要消化到靠近绒毛的地方才能有细胞，可是消化下来的还是羊膜上皮吗？
还有我的细胞原代长的很好，很快，可是一传代就停止生长，是为什么啊？

作者: qiaozhong.9876 时间: 2014-12-8 21:51

回复 coffee.cat105 的帖子- V4 {* w& M6 C V0 v
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我选取的是胎盘的胎儿面侧的那层薄羊膜进行消化的，那层细胞我们称之为胎盘亚全能干细胞，不知和你的是不是同一种细胞？我不知道你的那层羊膜状态怎么样，状态好的羊膜可以消化下好多细胞，有时候能达到10的9次方，这主要取决于羊膜的质量，这是我个人的经验，有的羊膜胶质比较多不好处理，还有就是要新鲜的羊膜，不要运输时间太长。关于你细胞传代不长，我觉得原代长的好的，传代也应该没问题，不知道你这种情况只出现一次，还是都是这种情况，如果都是这种情况那就麻烦了。

作者: qiaozhong.9876 时间: 2014-12-8 21:54

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我是新手，没有权限加你好友

作者: coffee.cat105 时间: 2014-12-9 16:27

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胎儿面是指胎盘拿到以后脐带的那个面的第一层吗？我消化过那一层很薄，上面很多东西，轻轻一消化就会掉下来，但是没有细胞贴壁，是我没消化对吗？) Q8 M- ?( H) q/ [) P- n
我都要消化到靠近绒毛的地方才能有细胞，这一层就紧贴着绒毛，又怕细胞种类不对，特别是它还不能传代。
你们一般是消化的胎盘上的羊膜还是胎盘周围的羊膜也可以啊？

作者: coffee.cat105 时间: 2014-12-9 16:30

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都是这样的情况啊，是不是细胞不对，您做这个要用胶原铺板不呢？我会先用没有铺的板把间充质先贴掉，在把上清转种到胶原铺的板里，这样做对不对呢？

作者: 听不到 时间: 2014-12-10 09:57

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我想问问你，你取得的羊膜是一层特别透明的吗？我最后取的是一层很透明的，特别薄的膜，我选了那个进行消化，贴壁了倒是，但是明显不是细胞，不知道是什么，碎碎的，我就怀疑我取得这层是不是不对。我是用载玻片把带血的一面完全给刮掉了，然后剩下一层极薄的近乎透明的膜，特别容易破

作者: 听不到 时间: 2014-12-10 09:59

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要用胶原铺板吗？...我是直接种的，但是不贴壁...

作者: 小段奥数 时间: 2017-9-14 11:35

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请问你最后是怎么处理的，我也是这种情况。刚消化下来的有很多细胞，但就是不贴壁？

作者: yanxm920 时间: 2017-12-18 11:10

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8 i. S9 k7 B) T8 B: A: E
求培养体系，最好能附上参考文献，一起讨论，谢谢！

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