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标题: hiPS传代后细胞成团状飘起原因是什么？ [打印本页]

作者: wangxiang 时间: 2014-12-26 08:31 标题: hiPS传代后细胞成团状飘起原因是什么？

hiPS传代后细胞成团状飘起有时又是单个细胞飘起的原因是什么呢？是基质胶的问题还是其他呢？求分析要注意什么。

作者: scottist 时间: 2014-12-26 08:38

基质胶不好的可能性较小，呈单细胞飘起比较正常，养过4-5天后都会有一些单细胞飘起，呈团片飘起应该考虑培养液的问题，太冷，或PH值不对，或有其他有毒物质都可能使整个克隆飘起。

作者: scottist 时间: 2014-12-26 08:39

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基质胶不好的可能性较小，呈单细胞飘起比较正常，养过4-5天后都会有一些单细胞飘起，呈团片飘起应该考虑培养液的问题，太冷，或PH值不对，或有其他有毒物质都可能使整个克隆飘起。

作者: wangxiang 时间: 2014-12-26 08:55

回复 scottist 的帖子5 `+ c* N$ M9 c: a

基质胶的话是稀释时温度没有控制好吧？应该商品本事没有问题吧、、、基质胶本身有没有问题怎么检测呢？

作者: wangxiang 时间: 2014-12-26 08:56

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是全飘。。。也是部分飘，只有极少的细胞贴壁了，其他都是单细胞飘死。。。

作者: scottist 时间: 2014-12-26 14:48

回复 wangxiang 的帖子9 u$ T$ o8 g6 M4 ?
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只要是正规途径买的BD的或Sigma的Martrigel，如果不是稀释时低温未掌握好，基本是不会有问题的。细胞在复苏或传代时大量飘起死亡很正常，hiPSC的存活率本来就较低，建议加入Y27632，抑制凋亡。

作者: wangxiang 时间: 2014-12-26 19:22

回复 scottist 的帖子4 H! L& a/ ^) g# e8 T( L
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谢谢谢谢，就是有时候稀释基质胶的时候可能稀释浓度不同，有时候是1:100，有时候是1:200，这样在不同的稀释比例的胶上来回传代会有影响么？十分感谢。

作者: scottist 时间: 2014-12-29 11:36

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你的稀释比例太大，根据Matrigel的浓度，一般稀释比例在1:50左右，应该不会超过这个比例，所以应该是你的Matrigel稀释有问题。

作者: wanglimaomao 时间: 2014-12-29 12:15

这个现象我以前遇到过。分析原因及解决办法可参考以下内容（本人经验）：
1.包被Matrigel是关键步骤，首先确定胶原质量是否合格，4°解冻后，是否为液态，如果是胶冻状说明不合格。稀释比例1:50-1:60,4°过夜，使用前37°固化至少1小时。经验表明，37°时间越长，底面粘附的蛋白成分越多，高背景下可见褐色蛋白丝，均匀分布。因为不同批次的Matrigel浓度不同，所以稀释比例会适当调整。或者延长4°和37°孵育时间。培养过程中，未用的matrigel孔要用胶原溶液养着，防止干掉。
2. 包被的6孔板一般2周内用掉，整个培养过程中，换液，都要轻柔，这些胶原有时候会容易脱落，而且细胞也会降解胶原成分，一旦胶原成分降解或者脱落，细胞就会成片脱落，凋亡。所以每次传代或者换液时候都要适当看看没有细胞的培养皿底部是否能看见蛋白丝。如果发现变少，是可以补加一点胶原（用细胞培养液稀释的），或者及时传代

作者: wanglimaomao 时间: 2014-12-29 12:15

纠正错别字，相差显微镜下是黑丝蛋白丝

作者: wangxiang 时间: 2014-12-31 08:22

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这个应该不会，我们实验室都是这么稀释的，只是我在想可能这个皿1:100，下次传代传到1:200铺胶的皿中这样会不会有影响。

作者: wangxiang 时间: 2014-12-31 08:29

回复 wanglimaomao 的帖子( ?% `% z" W* Q7 I5 F+ M3 z+ e" I

谢谢谢谢。这个我会注意的，思前想后应该和胶没多大关系，如果真是批次差异或是产品问题那没办法了，枪头预冷什么的都会注意，谢谢您。

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