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标题: 请大家来讨论一下四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态变化 [打印本页]

作者: 宋红卫song 时间: 2014-12-31 20:29 标题: 请大家来讨论一下四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态变化

自从实验室引进了OG2转基因鼠之后，小弟从月初到现在最近一直在做iPS诱导。用的Plat-E分别包装pMX-Oct4等四因子，采用脂质体转染法，用6cm皿培养病毒，得到的上清等量感染接种于6cm皿的靶细胞。靶细胞用13.5d的MEF，接种量：1.3X10e5/6cm皿。做pMX-GFP对照，侵染后3-4d有50%以上的细胞带绿光。
问题来了，我发现第二次侵染后的4天里，除了细胞的增殖外，几乎没有看到细胞其他的形态变化。手册上说四因子诱导的细胞在病毒感染后形态会出现变化，出现部分集中形态收缩的细胞；至感染后4d会有类似克隆的细胞聚集！！但我诱导了两次都没有观察到这些变化呀！求有相关经验的同行或大神们指点迷津，究竟四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态会发生怎样的变化？？会有上皮形态的细胞出现吗？我相信这也是诱导重编程过程中的关键阶段，大家来探讨一下吧，帮小弟指点迷津。如果有图的话就更好了！
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补充内容 (2014-12-31 20:35):& Y$ X* Z* u6 B
我用6cm皿培养病毒，得到的上清用其一半感染接种于6cm皿的靶细胞（1.3X10e5）。不知病毒量是否太低

作者: dabai22222 时间: 2015-1-1 01:29

有点怀疑你的病毒titer太低，很简单的方法你可以用四个因子的抗体染一下感染后大概48h的细胞的表达，要确保有足够的病毒感染

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-1 10:43

回复 dabai22222 的帖子" k9 ]! `2 Y C, Q \) s3 ~* H' f
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好建议。终于有回复了，谢谢你！

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-1 10:45

回复 dabai22222 的帖子7 c% B. L: y' J/ Y
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在病毒充足的情况下，感染1-5d（还没铺到饲养层，也不是无饲养层培养），这段时间会有细胞聚集或者类克隆出现吗？

作者: sylar.wy 时间: 2015-1-4 12:09

病毒收两次，感染两次，每次24h。

主要看你的OG2MEF状态好不好。数克隆可用12孔板做

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-4 15:09

回复 sylar.wy 的帖子' l5 e& q \$ i$ t) p
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嗯，谢谢你的回复

作者: 陈阳阳 时间: 2015-1-4 23:11

我们做的时候都是用的六孔板诱导的，然后转到铺过feeder的六孔板上。包病毒用的是10厘米dish,包装效率在80%左右。可以浓缩，也可以不浓缩。

作者: 陈阳阳 时间: 2015-1-4 23:11

OG2-MEF最好在三代之内，否则效果不好。

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-5 12:01

回复陈阳阳的帖子2 h( }4 b( D: u. [! t

嗯，我用的P1或P2。不知道侵染当天的靶细胞密度多少才合适呢？

作者: 陈阳阳 时间: 2015-1-5 12:24

我们是6厘米dish,10万个细胞。

作者: 陈阳阳 时间: 2015-1-5 12:25

错了，6孔板，每孔10万个细胞。一个孔足够了

作者: 牙牙丫丫123 时间: 2015-1-5 13:01

建议你使用浓缩后的病毒，这样病毒的滴度高。另外，你包装病毒时候的操作可能直接影响病毒的滴度。我们一般是10cm的皿包装病毒，两次收毒，得到的病毒浓缩，然后取浓缩病毒的1/10用于感染24孔板的1个孔的MEF，MEF汇合度约为30%

作者: ciweiyuan 时间: 2015-1-5 13:04

要先确认感染效率，我的经验是细胞状态和感染效率缺一不可。

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-6 10:44

回复牙牙丫丫123 的帖子, J! b7 L' Z9 _" }
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嗯，非常详细，谢谢！

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-6 10:46

回复牙牙丫丫123 的帖子9 i8 n3 f, C1 n! a, |

我使用的是病毒浓缩柱浓缩病毒，你们也是这种方法吗？

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-6 10:51

回复陈阳阳的帖子9 P w9 x y. X

谢谢你！

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-6 11:01

回复 ciweiyuan 的帖子3 X6 V' q' v! W6 H. ~) @
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很棒的经验，谢谢你！

作者: 牙牙丫丫123 时间: 2015-1-15 20:27

回复宋红卫song 的帖子, q4 O, I2 k$ r
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是的

作者: cicadacjk 时间: 2015-1-28 10:22

GFP感染后4-5d才50%感染效率，这样就不用往下做了4 ^# T* O8 g, x3 a5 m4 o! H k( W
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逆转录病毒对于小鼠成纤维感染能力极强，一般二次感染后就可以看到100%的细胞都是GFP阳性的。如果达不到这点，一般有几个原因：1.转染太差，GFP转染platE应该达到90%以上，而且要亮；2. MEFs太老，或者没分好，看MEFs的活力，细胞个头要小，培养基清澈，分裂快。

另外建议测下支原体，有支原体就扔了重做。

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-29 18:20

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谢谢！！

作者: 宋红卫song 时间: 2015-1-29 18:24

回复 cicadacjk 的帖子

我是用脂质体Lipo2000转染Plat-E, 按说明书做的，效率70-80%。怎么能把转染效率提高到90%呢，是不是有些别的诀窍或技巧？不知您用的什么转染方法？

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