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标题: 2i里面养mES容易漂如何解决啊？ [打印本页]

作者: hujine 时间: 2015-1-19 13:24 标题: 2i里面养mES容易漂如何解决啊？

如题，请各位大侠帮忙。！我在2i里养mES，用Trypsin-EDTA或Accutase消化传代都试过，N2b27稀释去上清或吸干消化液然后吹悬成单细胞。，但是ES形态很小且容易漂，想请教各位2i里面养mES有什么技巧或者有什么要注意的地方，谢谢！）细胞贴壁慢，克隆长不大，且容易飘起来。我的2i为N2B27+L-glu+NEAA+b-Met加2i和Lif。

作者: yuhaoze 时间: 2015-1-19 15:11

哈啊哈有意思，2i，我现在在Ying lab轮转，同样的条件没发现楼主的问题

作者: hujine 时间: 2015-1-19 15:36

回复 yuhaoze 的帖子& M% W H9 _2 I2 Y. \

真的么真的么？大侠，这已经困扰我好久了，刚开始以为是没中止胰酶，但Accutase消化也不行。看过Ying的paper上的克隆长得很大很圆，但自己养的就有问题，而且其他人也有发文说过这个问题加2%左右的血清才能解决。请问大侠你们的N2b27配制加BSA没？然后消化的具体步骤是什么啊？（例如胰酶消化后吸干么还是离心去除还是用其他消化液？）多谢多谢！！！

作者: yuhaoze 时间: 2015-1-21 08:39

实验室有人说2i lif condition，mES贴壁能力就是不如有serum的情况。
但是加了serum就不再是2i LIF condition了。
我自己培养的时候，用的就是N2B27+2i+lif，消化就是trypsin五分钟，然后终止消化，离心，重悬，贴壁用的时间会久一些。. m& s, c; X, y6 [% Z) l3 `7 \
细胞长的可以很大的，没有问题。其实不加LIF也行，直接2i养细胞一点问题没有，Austin Smith总想把什么都往LIF上扯淡，2i都不放过。9 \7 k, K+ Q5 U$ B Q3 x

作者: hujine 时间: 2015-1-21 13:59

回复 yuhaoze 的帖子+ {6 v) z2 J/ ] o. H

多谢回复！还想请问一下，你们的Trypsin有没有特殊要求，是0.25%Trypsin-EDTA么还是去除EDTA的？还有你们中止消化用的是N2b27还是血清还是其他中止消化的东东？我试过消化后吸干消化液再重悬等条件，细胞依然有一定漂的情况。我用的细胞系是我们实验室自己建的并且经过梯度更换驯化过来的，2i里培养一天两天贴壁还可以，但克隆稍微一长大就会漂。多次传代（约5代）依然有这种情况。培养液等都是新鲜配制的。希望大侠能继续答疑解惑！

作者: 陈阳阳 时间: 2015-1-22 16:49

mES非常好养啊

作者: splinkerette 时间: 2015-3-3 13:33

我也是有类似的问题，完全去掉血清就是长不好。不用2%，serum加到0.5%都长得挺好，但完全不加就是不行，加了又不叫2i的条件了，纠结。。怀疑跟细胞系不同有关系

作者: genedu 时间: 2015-3-3 13:54

细胞板子底部要铺feeder cells，消化用triple尽量把细胞消化成单细胞，换液稍微勤一点儿，不要等到克隆长到很大才传代

作者: hujine 时间: 2015-3-10 13:18

关于无血清培养条件是存在细胞系之间的差异的。如题问题是我刚开始做这个的遇到的，后面经过一段时间内摸索和查资料发现其实不要用含胰酶的消化液即只含一定浓度的EDTA可以完美解决该问题。Accutase试过，也不行。我的ES为C57背景的。希望这篇帖子对大家有用。Thank you！

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