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标题: 实验室细胞增殖慢，死的厉害 [打印本页]
作者: zkfootball    时间: 2015-1-29 10:22     标题: 实验室细胞增殖慢，死的厉害

大家好，我们实验室的细胞感觉增值不起来。
+ _7 o4 A2 ]6 u8 p4 ?: q- X* _1：293T原来2-3天传一次代，但是现在4天都没有达到可以传代的密度。4 m. C1 ]- v( P' g: f, B% o
2：养滋养层细胞（用于支持人的胚胎干细胞），如果是未用丝裂霉素处理过的，第一天贴下去还挺好，但是第2-3天就开始死的厉害。如果丝裂霉素处理过，在hESC培液里长得很好，在原先滋养层细胞培养基里（DMEM+10%FBS）就会死的厉害。3 k* h; W& `1 x# Y
3：已经检测过支原体，发现没有污染。也换过DMEM,FBS，也没有改善。
; l) ^  |. r& n3 A' Y现在都不敢养细胞了，请大家提一些可能的原因。谢谢！
作者: 奇幻雪蓝    时间: 2015-1-29 11:45

死的厉害是什么样子的现象？怎么死的？死的时候细胞是什么样子的？有没有变长或变大/变黑？培养基的颜色有没有变化或者PH值变化大不？
作者: yuanyecat    时间: 2015-1-29 14:29

细胞死亡的原因，
+ F. E9 N- a! _5 m- W. O8 g; H1 N1.真菌或者细菌污染。你除了支原体，细菌和真菌你检查了吗？. a9 j7 X( ^) r' Y2 ?
2，培养箱的问题，你检查了你们实验室的培养箱，温度，湿度，二氧化碳浓度都正常吗？不要看指示表，你这种情况是不是培养箱感应器有问题，要自己亲自测量一下。
/ K9 S% S4 Q) d. w" `3，滋养层细胞有问题，你检查了滋养细胞了吗？比如污染等
作者: zkfootball    时间: 2015-1-29 15:13

本帖最后由 zkfootball 于 2015-1-29 15:14 编辑 $ }& [1 Z2 c' @

1 ?# i; {4 s4 X) ~3 T3 p回复 奇幻雪蓝 的帖子
$ V( X3 @3 f7 y( A# A& l$ p$ `$ D
铺下去第一天的滋养层细胞
- J7 f$ r& U; O4 s* s铺下去后第一天观察滋养层细胞
* j' @7 C4 \; Z- E9 J# K: \- ^" n* M* j# g
铺下去第三天的滋养层细胞
# U' |* O- G8 @5 X, h* t; J) y铺下去后第三天观察滋养层细胞

图片附件: [铺下去第一天的滋养层细胞] 18925E7E-4280-4ECE-98E7-4EB11689AF16.png (2015-1-29 15:11, 586.18 KB) / 下载次数 487
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NjcyMTh8MTFmZTY5NGF8MTc5MzUyODUyN3ww



图片附件: [铺下去第三天的滋养层细胞] 46CA277F-6349-4852-B7FB-4B63FB6B0231.png (2015-1-29 15:12, 600.23 KB) / 下载次数 472
http://www.stemcell8.cn/forum.php?mod=attachment&aid=NjcyMTl8Njg3Y2NiYWF8MTc5MzUyODUyN3ww

作者: zkfootball    时间: 2015-1-29 15:16

回复 yuanyecat 的帖子
& x* O' ^; F; n* f0 [8 }# X; l
7 s1 c  f; _" h+ |5 u3 a1：真菌或者细菌感染应该可以肉眼看出来吧？我这个确实看不出来。& W2 A1 E% j/ D: t
2：二氧化碳浓度测试过，没问题。我准备再去测测温度和湿度。
% k3 j: Y5 C  n; ?- X3：这批细胞原来用都没有问题的，测了支原体，也是阴性的。
作者: zarecol    时间: 2015-1-29 16:39

细胞老化,还有可能是细胞营养不良，检查你的细胞来源和培养液中营养成分是不是有质量不过关的。
作者: zkfootball    时间: 2015-1-29 16:55

回复 zarecol 的帖子- B, [8 r" e# }

  }# O# m9 j0 h5 [  U- M好的，多谢！
作者: 宋红卫song    时间: 2015-1-29 18:27

回复 zkfootball 的帖子
6 T) H/ [9 m0 O6 M, Q6 a$ x% o
* g4 f) ^/ ~7 `' N) Z5 l: ?- t你饲养层细胞的制作过程是怎样的？如果是之前丝裂霉素处理后立即冻存，若丝裂霉素处理力度过大，刚复苏时饲养层细胞还是可以长得很好的，但过一两天就会死。可能是丝裂霉素处理力度过大吧。你说进行了支原体检测，用的什么方法，可靠吗？
作者: dahui    时间: 2015-1-30 08:36

回复 zkfootball 的帖子1 u4 I0 i4 x/ Z! u1 s" m& G
) o0 o9 O" U4 h; g
用的哪的血清，真心话，现在仿货太多，请留意。
作者: gd541767393    时间: 2015-1-30 09:07

本帖最后由 gd541767393 于 2015-1-30 09:09 编辑 $ M) U1 Z0 C9 R6 S( Y& T
1 l/ a) w. w. L: [. T& D
细胞如果以前用没问题，现在出问题，，跟细胞本身没有关系，是不是这一批次培养基缺少某种成分，或者说血清有问题，感觉像是营养不足，或者可以测下内毒素，和病毒是否感染
作者: zkfootball    时间: 2015-1-30 10:02

回复 宋红卫song 的帖子
+ Q& r9 N6 z0 a% P& j3 j/ Q' d3 O7 P& W; s0 w
恩，说的有道理。5 ~: v. S$ s0 q: z* a
支原体检测用的是试剂盒，做一个PCR反应，阳性阴性control都正常，我的实验组也没有P出条带。
作者: zkfootball    时间: 2015-1-30 10:03

回复 dahui 的帖子
4 k3 c( M, [. v* ?5 Y3 \" O" g
% f/ L* B2 ]# R" O5 y% R恩，换个GIBCO的试试
作者: zkfootball    时间: 2015-1-30 10:03

回复 gd541767393 的帖子( M" ^. S+ }% @% S
5 {5 M! s$ P: ?1 j2 e
内毒素和病毒感染该怎么检测呢？
作者: 宋红卫song    时间: 2015-1-31 10:22

回复 zkfootball 的帖子
2 S( \- k: Y- @! f0 U9 r: I5 x) x$ i* n: i$ v) A
可否告知您用的支原体检测试剂盒是那家公司的？我们上次购买了一个却不太好使。
作者: 维维睡啦    时间: 2015-2-28 14:38

你应该测一下内毒素，尤其是血清和培养基的，你们用的血清是否浑浊，有没有絮状沉淀，有的话就是血清的问题。
作者: afei198520    时间: 2015-3-3 11:53

回复 维维睡啦 的帖子- ?. T1 x4 O2 G/ \- L

1 }: N+ H9 ?  J+ z1 U我觉得楼主也应该检测一下血清的内毒素，我们之前买过某进口分装的血清，内毒素超标N倍，绝对没法想象
作者: zxmflying    时间: 2015-3-3 13:20

支原体你是用什么方法测的？所用方法检测阴性不一定就说明你的培养物中没有支原体——因为每种方法都有检测范围的限制。另外，你能排除培养基没有问题吗（如FBS）？建议重新复苏一支试试。



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