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标题: 小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常 [打印本页]

作者: 宋红卫song 时间: 2015-2-6 16:36 标题: 小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

病毒侵染2d后：/ K' F W1 c! A: ?: O6 f! D2 R
[attach]67403[/attach][attach]67402[/attach]
相应的pMX-GFP对照：
[attach]67403[/attach][attach]67402[/attach]
病毒侵染3d后：
[attach]67407[/attach][attach]67406[/attach]. A2 B/ ^: Y+ h: M+ G- I4 S! j8 P
到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。# h7 d& z; a* Z4 {' }
第9天细胞形态：
[attach]67412[/attach][attach]67411[/attach][attach]67410[/attach][attach]67409[/attach][attach]67408[/attach]

正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。
分析后，发现可能有以下原因：
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；$ M1 c5 d3 F- ]! }2 i
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；: h. y; ~ l9 x1 K1 t( q
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
4、其他原因。! s/ \( I$ U0 ]% \+ E- ]" l
希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？

补充内容 (2015-2-6 16:45):
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

作者: scottist 时间: 2015-2-9 14:30

回复宋红卫song 的帖子

从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

作者: saifast00 时间: 2015-2-9 15:49

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

作者: sylar.wy 时间: 2015-2-10 14:04

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧( t- Z! \. n1 I- ^0 w0 `
8 }/ f2 `5 h: W# f I# Z0 B. S
补充内容 (2015-2-10 14:05):, z# v: T1 ?1 B1 H$ o; ]
第九天- -

作者: 宋红卫song 时间: 2015-2-10 18:57

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+ U! W5 Q+ V" v, I' r D
嗯，感谢您的建议！

作者: 宋红卫song 时间: 2015-2-10 19:00

回复 saifast00 的帖子8 k4 H, a# d* m0 N1 y; Z2 |$ j

嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

作者: 宋红卫song 时间: 2015-2-10 19:02

回复 sylar.wy 的帖子

嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

作者: saifast00 时间: 2015-2-11 15:59

回复宋红卫song 的帖子

支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

作者: cloudycity 时间: 2015-2-12 22:21

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

作者: 琴心杜若 时间: 2015-5-5 14:44

本人新手，前辈进展如何？跪求指教

作者: 宋红卫song 时间: 2015-5-23 15:37

回复琴心杜若的帖子0 Q8 O2 t- N. n4 i
6 k% y2 K( E6 A- S; \& _3 T
上次刚做了一批，诱导成功了。你做的是什么方向？

作者: 祖传老军医 时间: 2015-6-17 13:59

请问LZ的鼠是在哪里购买的？GFP是全身表达还是特异性表达？

作者: 宋红卫song 时间: 2015-6-18 14:45

回复祖传老军医的帖子( K7 k" J( ~, @- @0 w* g- z

南京模式动物研究所。Oct4启动子连GFP，不是全身表达，在Oct4表达的部位表达。

作者: lchanlon 时间: 2015-6-18 23:57

9天的第一张相片和最后一张相片不是iPSCs, 那些细胞是transformed细胞，就能肿瘤细胞一样。不知道这样的细胞多不？不知道你是不是加了c-Myc。其他的几张应该是编程不完全的iPSC， MEF细胞最好是三代以内的，这样效率比较高，拿到iPSC的可能性比较。可能加在一下Oct4的用量，量可能是其它因子的两倍。

作者: 宋红卫song 时间: 2015-6-19 07:54

回复 lchanlon 的帖子
5 A' M4 y# e( z
用了c-Myc的，跟您的想法一致，我也认为很多“克隆”是transformed细胞。不知怎的这批实验细胞就是长得很慢，后来做的细胞就疯长了，也出了iPS克隆。感谢您的建议！

作者: 无涯 时间: 2015-11-3 10:34

应该不是病毒滴度不够，如果滴度不够，基本感染不上细胞。而你实验中细胞出现了明显的MET阶段，应该是病毒感染后四因子蛋白表达了，但是重编程后期克隆没有致密化。你的ips培养基可能有问题

作者: 宋红卫song 时间: 2015-11-8 11:55

回复无涯的帖子1 E; o7 G: z! q

嗯，后来也发现可能是培养条件引起的，跟病毒滴度无关。谢谢您的回复，我觉得是最中肯的了！

作者: 快乐小泡 时间: 2016-4-5 13:30

请问，我诱导第15天看到小的细胞簇，很亮，立体感很明显，不知道是不是正常呢？

作者: 快乐小泡 时间: 2016-4-5 13:32

回复 scottist 的帖子
: ?+ x8 E! \; o: L, W
请问，我诱导第15天看到小的细胞簇，很亮，立体感很明显，不知道是不是正常呢？

作者: 快乐小泡 时间: 2016-4-5 13:41

回复 scottist 的帖子
( Q- M) z6 q+ O
[attach]76801[/attach]这是诱导第15天时的细胞簇，请问这是正常的吗？

作者: 快乐小泡 时间: 2016-4-5 13:43

回复宋红卫song 的帖子

请问克隆刚刚出现的时候是什么样子的呢？能否给一张早期克隆的图片参考一下呢？

作者: 细胞海洋 时间: 2016-4-6 22:39

回复快乐小泡的帖子
- `+ m& w1 u6 n5 b) t4 w$ v: W
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作者: 张月儿 时间: 2016-4-11 15:01

9天以后可以再等一等，我们一般在转染后第11天才会挑克隆转移至feeder cell上。

作者: scottist 时间: 2016-4-25 10:36

回复快乐小泡的帖子) \% |+ e% s/ d1 U# I6 ^. G3 W2 P
0 U9 C( f5 @) `
你好，我看着不太像，15天的克隆已经很大了，克隆中的细胞排列紧密。你这幅图中好像是一个单独的细胞，圆形的东东应该是脂肪滴。

作者: linqun 时间: 2017-7-20 16:11

我和您一样的问题，能请教一下您怎么解决的吗？

作者: wang331212 时间: 2018-9-23 18:04

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