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标题:
鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）
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作者:
梦茹
时间:
2009-3-19 22:01
标题:
鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）
免疫组化染色（培养板中染色）
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1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
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2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
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3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
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4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）
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5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。
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6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。
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（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）
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SSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗
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所需溶液：
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4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
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问题向导 ：
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• 染色过深：
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⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。
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• 非特异性背景着色：
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⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；
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⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
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• 染色过浅 ：
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⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；
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