准备工作： ( v; Y* D' J, H3 TDF12 加入0.1%BSA，100ml,取10ml冰浴，40ml放入孵箱；其余的放入4度； 4 I% r0 W* r' D- `DNase I 100*; PI：50ug/ml; Hoechst33342: 1000ug/ml（all from Sigma）% ]8 o. m" z* @; a7 }* |. r! d
计数板，冰盒；各种离心管，无菌流式管（BD），400滤网（BD） " d9 e$ |# j4 E1 n& ?& D% f& C) H+ E7 }( y
染色方案：5 U0 }+ ^- t$ I* m0 X( v
① 细胞染色：) m; z1 h/ Y2 Y7 S! B& J
细胞消化计数，用DF12重悬，调整到1×106/ml浓度，分成三组2管；3 w0 v# Q6 j4 W
37℃DF12洗涤，制备成单细胞悬液；( C( s7 v% j8 N2 Q+ z3 g
两组均加入荧光染料Hoechst33342，使终浓度为6 ug/ml，其中CON组再加入维拉帕米，终浓度50 umol/ml；$ w1 ~# F4 m' _: O: K( D
37℃避光水浴90 min；# d" y D+ P2 K' F9 x) r
冰上10 min终止染色，计数细胞；离心细胞后，用冰预冷DF12洗涤细胞并重悬浮，将分选组调整浓度到1×107/ml以上，必要时加入1倍的DNase I； ( `% D, r. w+ w上机前再加入PI使终浓度为2 ug/ml. 并且400滤网过滤细胞 2 q: o0 r6 v- v' C②流式细胞仪检测： 0 \1 R# @# P) `- F- }: x4 y1 m. H355 nm UV激发光源，610 nm双色短通反射滤镜，450 nm和675 nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号. 测量前向散射和侧向散射二维参数图，检测细胞均一性，以Hoechst Red为X轴，Hoechst Blue为Y轴作二维散点图，将低Hoechst Red及低Hoechst Blue且维拉帕米组缺失的区域设定为SP细胞的“门”（gate），计算百分比. 分选出SP细胞及Non SP细胞., m, ?& j) G+ o0 X
) v+ X: p% x' X& C: E" r, `2 h9 T8 D2 d) J% \
goodell的sp分选. a1 `) P) H; g D http://sciencepark.mdanderson.org/fcores/flow/files/SP.pdf： 2 o; p2 |$ V5 {+ X! ?: ?; NHoechst 33342 Cell Staining and Side Population Purification Protocol0 Q* e) s+ M4 J+ n( d
(see Goodell, M., et al. (1996) J Exp Med 183, 1797-806) , U0 o7 z% T4 [, n7 {The ability to discriminate Hoechst SP cells is based on the differential efflux of Hoechst; \6 l5 i k6 J$ x0 {* Z! h( N) N
33342 by a multi-drug-like transporter. This is an active biological process. Therefore, 0 y3 A+ ?- ?& v! noptimal resolution of the profile is obtained with great attention to staining conditions. / U8 C! }1 l9 oThe Hoechst concentration, staining time, and staining temperature are all CRITICAL. / V1 f* F/ A9 h! eLikewise, when the staining process is over, the cells should be maintained at 4°C in2 A, H1 p6 w4 O5 |6 p0 ^' Q
order to prohibit further dye efflux. ' N& ^- O7 u! B, H6 E1) Ensure that a water bath is precisely at 37°C. The medium needs to be prewarmed2 k. g: y8 g, ~' D- M6 i+ d. k
beforehand.. z7 u+ [* E- t
2) To thaw cells from the cryovials, put them directly from dry ice into the 37°C 9 o) b& }& w* x. G, }# k3 Hwater bath. Once the cells are thawed, wash them once by transfering them to a ) R; y+ D) }( \) l z0 ?centrifuge tube, adding 9 mls of their respective media, and spinning for 5 " A6 X7 ]. z% \; q( eminutes at 1200 rpm in order to remove the cryo-preservants.9 B: ]5 @; j- r$ Q5 O7 Y$ r; o/ |! x
3) Resuspend at 106 cells per ml in pre-warmed DMEM+5% FBS. Mix well.3 d: G/ i. R0 A+ M1 n: N: H
4) Add Hoechst to a final concentration of 5 µg/ml (a 200x dilution of the stock).* A7 j6 v. c2 e8 N- T$ ~! a
5) Mix the cells well, and place in the 37°C water bath for 90 minutes exactly. Make 8 L: g& ^7 s6 Z1 q! ?6 @8 Usure the staining tubes are well submerged in the bath water to ensure that the- w, ?: r- p/ x7 o
temperature of the cells is maintained at 37°C. Tubes should be mixed several 1 i; \! p" ~ Q$ l6 i6 {times during incubation. ( w. G0 P. U3 S6) After 90 minutes, spin the cells down in the COLD and resuspend in COLD& E0 u9 `! p% E# [. M
Phosphate Buffered Saline (PBS). 3 W2 U. _4 ?' T7) All further proceedings should be carried out at 4°C to prohibit leakage of the - Z6 }2 H) @. D2 LHoechst dye. Add 2 µg/ml of 7-AAD to the suspended cells (a 100X dilution of 7 Y& x( t6 n2 g" u* _5 w2 wthe stock provided) and mix about 5 minutes before FACS analysis. This will/ u3 u+ L$ u8 a2 r' K. O
allow for the discrimination of dead versus live cells as 7-AAD permeates only$ A0 u7 I! j- [% V5 c
cells that do not have an intact membrane. " m# l- W9 ^* F9 d6 O. P* M+ Q' l" R% f4 P6 F5 o
0 w5 C# ^1 R; W9 _( b, _- `: q6 M ; N; E6 T) G7 E/ | j# b这是我收集的SP分选的方法：与大家共享。 G- j; r A" ^$ z/ \7 R6 b F
一 Hoechst染色方案 * N) a* T6 ?/ h I$ a7 Q1. 在37℃循环水浴箱中预热DMEM+培养基。确保温度为37℃。- n" B1 }8 l5 ]
2. 重悬细胞于预热的DMEM+培养基中，浓度为106/ml，为了避免细胞留在试管中，所以在Hoechst染色时必须用聚丙烯试管。当要染大量细胞时，在250ml聚丙烯试管中最为便利。 6 S( @5 G# s% T+ H8 T( `$ b3 加入Hoechst至终浓度为5μg/ml。我们建议用200 的原液(1 mg/ml)，它是将一整瓶Hoechst粉末溶于水中(B2261, Sigma)，再分装，保存浓缩的Hoechst溶液在－20℃1 U" y, |2 r' b% N
4 将细胞在37℃循环水浴箱中预热，在90 min 的孵育中定期混匀试管。时间和温度对于Hoechst染色来说特别关键，所以DMEM必须预热而且试管必须完全没于水面。 # J; M q" p1 Y" d5 Hoechst染色完成后，细胞必须处于4℃以防止Hoechst继续外排, 绝不能加有Ficoll或其他别的延长高温的程序，因为这些可以导致非干细胞的其他细胞的染料外排，最终导致真正SP细胞的纯度降低。细胞4℃离心，并重悬于冰的HBSS+。 5 ^2 U. w* {! `6 抗体的染色这时可以在冰上进行。为了保证干细胞的纯度，加入干细胞特异性抗体，其浓度取决于参考各自的滴度，或厂家提供的说明书。所有的染色和离心必须是4℃。 ' x+ e8 E! r8 c+ T5 }7 当用FACS分析细胞时，重悬细胞于冰的HBSS+，同时加入 2μg/ml PI 以区分死细胞，尽管PI染色在ＳＰ并不完全需要，但还是强力推荐。Hoechst对有些细胞有毒，PI可以分出死细胞，使Hoechst发散图更简化。, F# Q' A5 q- u
8 试剂1 L" z- w- g1 C- }) i* Z
DMEM+ ：高糖DMEM (Cat No. 11965‐092, Gibco Invitrogen) ' v+ O/ P7 S6 L/ U* VPenicillin/streptomycin (Cat No.15140‐122, Gibco Invitrogen)( @# K7 L, y0 W
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen)# f/ o: ~4 p8 }
2% Fetal bovine serum/fetal calf serum& u/ G- J% D) x! R
HBSS+ ：Hank’s平衡盐溶液(Cat. No. 14170‐112, Gibco Invitrogen)0 _1 \5 R1 R& A( @( X
10 mM HEPES（羟乙基哌嗪乙磺酸） (Cat No. 15630‐080, Gibco Invitrogen) [; n5 i& J# d) j# N2% Fetal bovine serum/fetal calf serum$ L& d) E' G! ~4 L# r d$ ?/ [3 `; W
Hoechst 33342粉 (Cat. No. B2261, Sigma)：200×原液(1 mg/ml) 的制备，将Hoechst 33342粉溶于过滤除菌的蒸馏水中 ，Sigma公司的Hoechst 33342粉刚好可以得到500ml溶液，强力推荐一次性将Hoechst 33342粉立即溶解，然后用每ml分装冻存。冻融的Hoechst份尽量少的再冻，以免使水分增加。 , g( L q: f* U! Q, i/ H y7 a, f
（PI）Propidium iodide (Cat. No. P‐4170, Sigma):工作浓度为100×（200μg/ml）溶于ＰＢＳ，并用铝箔纸遮蔽，重悬于HBSS+终浓度为2μg/ml。 . B7 M6 [5 |# L) j5 D \: ^+ X6 Y+ y- Q
二 Hoechst－染色细胞的抗体染色法和磁珠浓缩法方案2 \9 h& T" {4 b5 f- u3 p6 ?: J3 i
１Hoechst染色结束后，重悬细胞于１×108 cells/ml 冰的HBSS+，在冰上将生物素酰化的抗体与细胞共孵育10min。（抗体的稀释剂滴度按说明书进行）/ }2 O- g% ]* W) V) S, B
2 用10倍体积的HBSS+洗去未结合的抗体，在低温离心机中离心。6 B7 _; E7 z) A
3 用磁珠小体标记细胞，从Miltenyi Biotech (Cat. No. 130‐090‐485)得到抗生物素磁珠小体。将细胞与20% 体积的磁珠小体在4℃条件下共孵育15min。我们发现，如果在冰上孵育，则磁珠与抗体标记细胞的效力会下降。还是在4℃冰箱中孵育较好。" Y' L0 ~: |( \0 d
4 用10倍体积的HBSS+冲洗细胞，在低温离心机中离心。' `3 E( J. g8 }2 ]2 B3 e
5 重悬细胞于2×108 cells/ml于冰的HBSS+，细胞调整至流式细胞仪分析所需的容器。5 T5 H6 B/ ]6 Y% X! T: [
三 Hoechst SP细胞的流式细胞仪分析 e) H) f3 g. }" u) V
1 Hoechst 33342的激发：要观察到ＳＰ，必须用紫外激光器来激发Hoechst 33342 染料和PI。紫外激光也会有较好的效果(Simpson et al., 2006)。Hoechst在350 nm波长被激发，另外的激光如激发FITC 和PE 的488激光可以用来激发其他的荧光染料。 " O7 J; E& e# A, k4 v２ Hoechst发散的探测：Hoechst染料的发散用两个探测器来测量：Hoechst Blue和 Hoechst Red。Hoechst Blue用450/20滤光片测量，Hoechst Red用675LP滤光片测量。用一种分色镜（我们用610 DMSP）来分离发散波长，PI荧光亦用675LP通道来测量。但他的阳性信号要较Hoechst Red信号更亮。可以用488激光同时激发和发散PI，用来将死细胞从发红色荧光的活的Hoechst染色的细胞中分离出来。同时，别的滤光片也可以应用，但这里推荐的是做好的。 ; P/ r. k4 }5 A. y还有，一种高能的紫外激光(50–100 mW)可以最好的分选SP。低能也许够用，但群不一定很清楚。最关键的是，SP可以被其阻断剂—维拉帕米，一种抗体共染，特异性的针对SP鉴定。) X" K' O6 |' D. k/ ?
3 流式细胞仪分析：Hoechst荧光显示为Hoechst BLUE 对 RED散点，BLUE在Y轴，RED在X轴，都是线性，电压调整后，红细胞在左下角，PI染色+的死细胞Y轴的极右端，多数细胞在中心位置，或右上方。也有可能检测到一大部分 G0–G1及 S–G2–M cells 在右上方。: d. q* c5 y# K; `! T
为了能看到SP细胞，画一个取样门将红细胞和死细胞排除，一个未浓缩的骨髓细胞样本，取样门可以有50,000–100,000细胞需要SP鉴定。SP区要像图示来画。对于一个未浓缩的鼠骨髓标本来讲，SP细胞的数量大约为0.01%–0.05%，SP细胞在正常的鼠骨髓细胞显著的大于这个‐0.05%提示Hoechst的弱染色而受非SP的污染。这完全可以想象，SP细胞中有一些细胞不表达经典的造血干细胞表面标志。如果染色进行的适当，SP细胞的65 —95% 会有经典的造血干细胞表面标志，这些可以用来纯化侧群细胞。, g. V, H. [! u) A
4 操作FACS的要点：Hoechst的发散是呈线性的，好的CVs对于SP鉴定至关重要。要保持好的CVs，重要的就是要用能紧密地分布线性样式的颗粒 (DNA check beads, Coulter)来校准。另外，低的样本分压同样重要。最大的样本分压不能快于用校准颗粒校准的定标。骨髓细胞可以较高浓度来分析，以保持低样本分压。% o) W. b. H- G% n4 z: E
5 好的SP染色的证实 " i' Y( T% c: W4 a. @（1） 共孵育维拉帕米处理过的对照来确保SP 可被清除。在Hoechs染色的整个过程中加入终浓度为50μM的维拉帕米，经维拉帕米处理后，SP细胞可以被阻滞。0 X' |( U8 S' q8 b, S
（2） 用抗体共染色：SP细胞里富含干细胞，好的Hoechst染色中60%–80%的SP细胞为干细胞表面标志物阳性细胞。作者: 火云豹 时间: 2009-12-16 00:42