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标题: 细胞复苏失败原因？ [打印本页]

作者: lvyananwyb 时间: 2015-3-3 11:09 标题: 细胞复苏失败原因？

前两天复苏细胞，完全没长，并且没有污染，是什么原因呢？是不是由于复苏动作慢，DMSO对细胞损伤太大而死亡的？请各位给分析一下，谢谢

作者: sxlxw2012 时间: 2015-3-3 11:13

我不知道

作者: afei198520 时间: 2015-3-3 11:35

什么细胞？复苏条件？用了多长时间？接种密度有没有问题？什么都不清楚就什么也没法分析

作者: 晴斗斗 时间: 2015-3-3 12:42

影响因素太多了，细胞冻存的时候状态,细胞冻存条件，复苏条件，培养条件……

作者: zxmflying 时间: 2015-3-3 13:17

是不是冻存的时候细胞状态就不好了？还是复苏的时候在水浴中的时间太长？还是培养基有问题？是不是有支原体污染导致细胞状态很差？还是CO2培养箱有问题？所以建议楼主一一排除原因。最快的方法是复苏一支别人已证明OK的细胞试试。

作者: dollar007 时间: 2015-3-3 13:47

影响因素太多：收获时消化可能过渡；冷冻时过程控制不佳；复苏时解冻温度、解冻速度太慢，都会影响到细胞的活性。

作者: tsk0909 时间: 2015-3-3 14:03

首先确定细胞冻存前状态，冻存过程无差错；冻存液各项液体是否都加；冻存时冻存管是否拧紧；复苏时水浴温度是否合适；复苏速度和离心转速是否合适；复苏细胞分装问题，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞贴壁存活。

作者: yaolinzhang 时间: 2015-3-3 14:09

回复 lvyananwyb 的帖子) G& i* K2 b: z% ^# v. F

坚持“慢冻快融”原则，复苏时要尽可能快；培养基提前预热；鉴于楼主情况，估计：冻存液有问题；复苏时间太长。

作者: tess1029 时间: 2015-3-3 14:42

原因太多了，有可能有以下几种：1 @ J5 J! F1 Z$ h* ? i: H. `
1冻存前细胞状态就不好；
2冻存液的问题，配置比例不对；
3复苏时时间过长；
4培养基问题，培养条件等

作者: 张钰0206 时间: 2015-3-3 16:48

除了以上几位说的，我再说几点：* B% ] t- U4 J9 Z' P2 A
1.复苏时如果离心洗涤，可以用冰浴的生理盐水，减少细胞损伤。' b m7 d! f1 k0 c4 a7 s
2.离心转速不宜过高，不超过1500rpm，如果离心对细胞损伤大，则可以先种瓶，24h后离心换液。! y! s% W5 C$ l" d* o
3.如果冰冻的细胞需要过长的时间送达实验区，则可以事先准备一个泡沫盒，在泡沫盒中装液氮，把细胞放入其中，到实验区再把细胞拿出。
4.复苏时加大细胞的密度，可适量添加血清增加营养。

作者: lvyananwyb 时间: 2015-3-4 09:18

谢谢各位的分析，细胞是别人冻存的间充质干细胞，以后复苏时会注意操作速度，以及复温时间的控制。

作者: colins 时间: 2015-3-4 09:20

我觉得如果经常做的话不至于因为复苏动作慢就导致细胞完全不长，完全没长的话就不单应该从操作上找问题，可以试着从细胞本身找原因，是不是在冻存时出问题了？如果是在学校的话，有没有可能你们的冰箱断过电啊，这些都有可能，我就遇到过。至于污染问题，我觉得最好自己真正检测一下，尤其是支援太，肉眼看不到的

作者: cloudycity 时间: 2015-3-4 13:04

我觉得是冻存前细胞就不行了，或者冻存的条件不行。你是在什么条件冻存的？冻存条件不是稳定超低温，就很伤了。
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复苏的话尽量快，我都是用40℃复苏的。你用的冻存也dmso比例是多少？我曾经试过msc在5%的dmso 37℃复苏后放置常温30min，活率都有6-7成。

作者: chenlin080102 时间: 2015-4-18 14:56

最佳的复苏过程应该是尽量缩短水浴锅溶解的时间，然后加入到预温好的培养基中，培养基体积至少是冻存细胞体积的9倍，也就是说要做10倍稀释；还有就是不建议刚复苏的细胞就离心，因为此时细胞很脆弱，建议第二天再离心换液。

作者: woshibotao_01 时间: 2015-4-19 21:46

觉得应该先想想冻存前冻存方法是否合理。如果合理，再找复苏的原因。
复苏时水温在38度，将冻存管快速投进水中，并摇晃冻存管，使冷冻细胞悬液在一分钟之内融化，然后立即取出。
将细胞洗涤，目的是把DMSO洗掉，离心力不要太高。
最后用平衡至室温的培养基培养。5 j7 g }6 d" R4 R
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作者: 帝国黑骑士 时间: 2015-5-9 08:54

楼上的前辈们说的都有道理并且比较全面了，细胞完全没有长，这个很奇怪，操作上的一些问题不会导致完全不长，所以我觉得最大的问题可能出在DMSO上，要么是冻存时出问题，要么是复苏时冻存液清洗不彻底，残留的冻存液对细胞生长有很大影响。建议再重做一组冻存复苏的实验，排查下原因。

作者: zhrt 时间: 2015-5-9 11:54

回复 lvyananwyb 的帖子2 @# l9 y" b& S& E- m- p4 W
4 T6 ~* w/ k7 _  p$ V, i6 R- _& u
1.接种密度过低7 X) \7 v" K8 {, x3 B  A. j: I8 {
2.细胞活性太低（1.酶消过长2.本身细胞状态不好）, K5 ?8 c  p' u0 F( p7 _1 \4 s2 ^
3.DMSO的浓度及添加时机

作者: a2782953 时间: 2015-5-10 12:05

回复张钰0206 的帖子1 F. a7 B& {/ Y; {7 y* T- h
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我想问下，冰浴的生理盐水会减少细胞损伤的原理是什么呢？谢谢！

作者: yuanyecat 时间: 2015-5-14 11:16

复苏要素
第一，dmso必须洗干净，推荐用medium洗两次，
第二，种密度适中，推荐100000-500000个每毫升

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