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标题: 分离单核细胞时，如何吸取白膜层？ [打印本页]

作者: lxy07 时间: 2015-3-10 14:55 标题: 分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

作者: wanglinling 时间: 2015-3-10 16:06

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

作者: wanglinling 时间: 2015-3-10 16:10

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

作者: cloudycity 时间: 2015-3-10 16:11

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。
2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。0 I( K' d$ M$ G
3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。
4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

作者: lxy07 时间: 2015-3-10 16:19

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是50ml离心管，降速已经调低了。

作者: wanglinling 时间: 2015-3-10 16:24

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那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

作者: lxy07 时间: 2015-3-10 16:48

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1、是人的，Ficoll也是分离人的。
2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。
3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。
4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

作者: lxy07 时间: 2015-3-10 16:54

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你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

作者: 维维睡啦 时间: 2015-3-11 08:50

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。
2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。 z+ H8 \3 V/ G! M
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。. O/ f/ F! p1 } x9 Z
5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。

作者: lxy07 时间: 2015-3-11 14:03

回复维维睡啦的帖子* x& F+ d2 M1 V9 K$ w

1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。1 ]0 w0 T/ x6 U7 P* k: a
2、去血浆，稀释了。
3、FICOLL和血细胞有明显分层。
4、升降速调低了。$ n1 r8 {/ x9 p' x% [) r# o
5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。

作者: fenlichong 时间: 2015-3-11 14:08

白膜层一般规范操作应该能观察到明显分层。操作时注意：1、待分离液恢复到室温后，将其从离心管底部加入，禁止沿管壁加入；2、将稀释后的血液沿离心管管壁缓慢加入，铺层要缓慢细心，控制血液流速以免流速太大而冲击铺层界面；3、盖好配平离心，全程动作务必小心，防止液面混合；4、离心完后，可见分层。用5ml移液管小心吸取白膜层，可边轻转离心管边吸，尽量吸干净。另：使用分离管分离白膜层效果较好，可试试。

作者: 维维睡啦 时间: 2015-3-11 14:38

你用的多少毫升的离心管？先把最上层吸出来弃掉，再吸中层，白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在0.5公分左右即可，这样可以尽量减少细胞损失，也不容易引入其他杂细胞，效果很好。

作者: cloudycity 时间: 2015-3-12 17:47

回复 lxy07 的帖子: R% @& v. W0 [. z

没什么必要···个人觉得，只是追求技术上的完美···哈哈

作者: cloudycity 时间: 2015-3-12 17:57 标题: RE: 分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

你具体的操作是怎样的？" j, Z! [8 i8 V
血液如何稀释？在ficoll上铺血铺地好不好？血和ficoll的界面有没有被弄乱咯？如果都做好了还不明显。那就是太稀/血不行····

作者: zz091115 时间: 2015-3-12 19:27

15ml离心管比50ml的效果好可能是液体张力的原因吧还有个就是你离心结束一定要慢慢减速不要迅速从400g降到0 这个非常重要

作者: wanglinling 时间: 2015-3-13 16:05

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+ y$ ^% g! g, ` \2 g8 w& }! r
去血浆是什么意思？怎么去的哦？

作者: lxy07 时间: 2015-3-13 16:31

回复 wanglinling 的帖子. _8 j& l }" {) h" \$ F- Q4 [
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全血加入50ml离心管，2000rpm，15min，离心后会分层，然后把最上层的血浆吸掉。

作者: wanglinling 时间: 2015-3-13 16:33

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你是白膜层一点都看不到还是只是细胞少而已

作者: lxy07 时间: 2015-3-13 16:37

回复 wanglinling 的帖子! b/ }/ Z4 w" ]1 J6 M
! U' U; ]6 F! ]. r t) l. Y( |- K
离心管平视的话，白膜层和分离液层基本分不清楚，混在一起了，从离心管上面俯视看的话，能看见白色云雾。

作者: wanglinling 时间: 2015-3-17 16:43

回复 lxy07 的帖子# e( W8 B, K4 o m
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那还是梯度没有弄好，换一种分离液试试吧，不知道你们用的哪种？

作者: 孙帅帅 时间: 2015-4-7 09:07

离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，即单个核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞和低比例的干细胞，此外还含有血小板）

作者: 孙帅帅 时间: 2015-4-7 09:09

分离人外周血单个核细胞，理论上1ml血能够得到1-2×106个单个核细胞，每次分离都可以得到106个/ml细胞。另外，分离时一定要注意血液稀释是等体积稀释，稀释后血液与分离液的比例是2：1，书上说是10ml稀释血用3－5ml分离液，但通过我的经验是2：1分离效果比较好；再有就是离心速度和时间，一定是20℃ 2000rpm，20min。

作者: luckyliu 时间: 2015-4-28 10:07

个人感觉分离白膜层，关键点有四：首先，血液是否新鲜；其次，是加液，在将血加入分离液中时，是否操作到位，血与分离液有明显的分界；第三，离心速度，离心速度不够的话，白膜层也会不显著；第四，是离心机的制动速度，一定要调至最低

作者: yuanyecat 时间: 2015-4-28 10:33

我推荐用GE的ficoll，15ml离心管离心。管直径越细，分离效果越好

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