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标题: 请各位大神帮忙看一下我的WesternBlot实验结果是什么原因 [打印本页]

作者: 木三阿凉 时间: 2015-4-15 15:55 标题: 请各位大神帮忙看一下我的WesternBlot实验结果是什么原因

蛋白分子量较小，在 25-20kDa 之间，电泳条件为：第一阶段恒压80V 30min，第二阶段恒压100V 90min 。转膜条件为：恒流0.2A 120min。7%脱脂奶粉封闭3h，一抗过夜，TBST洗膜4次，每次10分钟。二抗孵育2h，TBST洗膜4次，每次10min。

图片附件: 44E58794-E32A-431B-880E-1070B03A58C2.png (2015-4-15 15:54, 52.13 KB) / 下载次数 252
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作者: 木三阿凉 时间: 2015-4-15 15:56

下面这张是内参/Users/pro101/Documents/实验结果/WB实验结果/2015-04-15/44E58794-E32A-431B-880E-1070B03A58C2.png

作者: 木三阿凉 时间: 2015-4-15 15:58

作者: 木三阿凉 时间: 2015-4-15 16:26

蛋白表达量低，所以上样量为80ug，一抗是小鼠的单克隆抗体

作者: luckyliu 时间: 2015-4-15 17:14

不知道是拍摄出来效果不好，还是本来就这么暗，有两点建议：$ Q' q2 o% R. n# r3 n% O
1，第三泳道条带变形，可能是胶配的不好，没有混匀；
2，条带不太清晰背景较多时，建议一抗二抗都用10%脱脂牛奶+TBST孵育

作者: 木三阿凉 时间: 2015-4-15 17:17

回复 luckyliu 的帖子

嗯！好的，谢谢你~

作者: liuyasi2008 时间: 2015-4-17 12:02

建议降低一抗浓度和减少曝光时间，杂带太多了。上样太高可以延长跑胶时间降低电流强度，跑的胶会好看一点。

作者: 木三阿凉 时间: 2015-4-19 12:29

回复 liuyasi2008 的帖子- i9 d) }4 M* m6 q
- [- L9 w2 ]2 h* \: ~5 t
嗯，好的！谢谢你~~

作者: daviddow 时间: 2015-5-27 17:17

可能有2个原因考虑：1一抗的原因；2是TBST没有洗涤好

作者: moluxingke 时间: 2015-6-1 09:10

在白光下居然都能显出条带，这种情况还真少见呢，看来你蛋白上样量或是抗体浓度都需要调整，上面如果有你的目的条带的话，根据目的条带的强弱，调整蛋白上样量吧，如果很强，那就把抗体再稀释一下，曝光时间减少一些，另外，你没有必要用那么大的膜去显影吧，将膜剪细一点，只保留你的目的条带的位置就行了，当然如果你还有其他位置很相近的条带就另当别论了。
PS，转膜过程再好好检查一下，是不是有哪些小细节没有注意好？

作者: 木三阿凉 时间: 2015-6-5 15:43

回复 moluxingke 的帖子
8 H( Y( T0 x( p6 x; O* K; i9 L
收到~！谢谢大神~

作者: yuanyecat 时间: 2015-6-5 15:55

抗体的特异性不高，而且你蛋白的上样量太大了

作者: 木三阿凉 时间: 2015-6-6 09:12

回复 yuanyecat 的帖子
6 i* u, X& C* a& u
哦~ 好的~ 收到！谢谢大神~

作者: 121qwq 时间: 2015-8-5 09:54

好难看啊，都搞什么了

作者: beyond2008 时间: 2015-8-25 11:42

小蛋白要用12%的胶，配胶的时候一定要混匀。电泳时，60V 20-30min 浓缩胶，80v 分离胶，时间自己看。然后牛奶封闭过夜，以减少背景。

作者: 木三阿凉 时间: 2015-9-4 21:15

回复 beyond2008 的帖子- X+ P, F! b$ O! I; y$ N3 ]4 s7 N* n
0 n' K' B$ P" g4 A- z
好的~ 多谢指点

作者: 2014052 时间: 2015-9-11 12:34

单抗自己做的还是买的？这种实验最好有多抗，多抗是各种单抗混合物，其中会有不少亲和性较好，所以一般多抗做出来信号会强些，那么通过调整一些实验条件，就可以让自己的目的条带变得很清晰很好看，从你上样量那么多来看，抗体质量很一般

作者: xcf20305 时间: 2015-9-24 15:35

建议：
1. 重新做胶，胶一定要做好，再跑PAGE，这样条带会干净漂亮一点；4 g* A# l: z0 Q" S9 ~) S
2. 条带不清晰，所以曝光时间过长，产生了杂带，因此建议缩短曝光时间；: E1 O/ ^9 p- n8 k0 W. x
3. 杂带处理：增加洗膜时间和次数。

作者: 木三阿凉 时间: 2015-10-12 10:14

回复 xcf20305 的帖子$ D/ b' M" M' N/ Q
7 p: z+ \1 g6 `- f0 B+ ?3 Z
好的，谢谢~

作者: realyy11 时间: 2015-10-12 11:59

用传统胶片曝光的方法试一下吧效果可能会提高一些

作者: baby00000003 时间: 2015-10-12 14:38

最右面的泳道转膜变形了，是不是混入了气泡的关系哩？
这个是转完膜用丽春红染的么？可能上样量有点大....

作者: 木三阿凉 时间: 2015-10-14 16:04

回复 baby00000003 的帖子, M" W' m" X7 C3 {6 _
, U5 i: M! ?0 i# Z
没有用丽春红染~ 那我减少一下上样量

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