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标题: 关于脐带间充质培养的问题 [打印本页]

作者: hwlightning 时间: 2015-4-20 15:47 标题: 关于脐带间充质培养的问题

最近处理了一份15cm长脐带，剔除羊膜、静动脉后，用眼科剪剪成很小很小一块，用组织块贴壁法做了10皿，培养箱倒置了2个小时后，加入3ml培养液。期间一直没管，第三天观察，组织块变得很肿大，而且有的已经飘起来了，不管了，添加5ml培养液，再过3天，组织块飘了一大半，也没看见细胞爬出来。又过了3天，把飘起来的组织和培养液都去掉，重新加入10ml培养液，到现在12天了，都还没看见细胞爬出来，各位帮我看看是哪里出了问题了？？？？* h, c+ V1 ]( g
我分析了下，一个是组织块没有贴壁贴牢，二是培养液的更换时间问题。
给位同仁帮我看看到底是什么问题？

作者: 小小龙001 时间: 2015-4-20 16:31

我们一般做的时候都不倒置培养，主要是制备完成之后不要轻易去动或者摇晃，要给他们贴壁的机会，而且换液不要很频繁，尽量半量换液，在最大程度上减少环境改变对细胞的影响

作者: 20084720113 时间: 2015-4-20 16:37

2个小时时间是不是有点儿短，你可以过夜（24h）静置试试，这样飘起来的组织块就会少很多；另外组织块不能剪太小，1-2mm3大小应该比较合适；你用的是9cm的皿吗，开始时3ml培养液是不是有点少，8-10ml应该比较合适；第一次换液可以等个5-7天在换液，一般在10天左右可以看到少量细胞，此时最好再次换液。12天还没有看到细胞也很正常，一般DMEM+FBS的培养基会比较慢一点，组织块飘的太多也会影响你的观察，剩下的组织块再耐心等待吧，说不定明天你就能看到惊喜。

作者: hwlightning 时间: 2015-4-20 16:43

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不加任何东西就24H静置？我是用的9cm的皿，应为是做临床我是用的商品化的培养基。

作者: hwlightning 时间: 2015-4-20 16:47

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我制备完我都不会动，三天后才会拿出来看看。可就是贴不住

作者: 20084720113 时间: 2015-4-20 17:20

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里面会有少量的培养基，具体多少还真不好描述，一般刚好能重悬组织块就行了；我用的是瓶，透气性好，培养箱湿度大，放24h没什么问题的，皿的话不太清楚，你要是怕干了的话可以放8-12个小时试试，总觉的2h太短。

作者: 20084720113 时间: 2015-4-20 17:22

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贴的不牢的话，你加液很容易就起来了

作者: deshenglll 时间: 2015-4-21 10:45

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不用倒置，直接加进去就行了。用倒置都落伍好几百年了。直接将组织加皿里，3-5天就能有变化，长的快的组织块边缘会变圆。

作者: hwlightning 时间: 2015-4-21 17:03

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你们一根15cm脐带可以做几个90cm培养皿（或者t75培养瓶）？做开始的培养基加几毫升？

作者: woshibotao_01 时间: 2015-4-22 13:57

不知道楼主所说很小的块儿具体体积是多少？% f7 F1 d& s0 G, w
块飘起的程度应该和这几个因素密切相：一是铺皿后到加液的时间，2H感觉有点短，可以试试时间加长一些，使组织贴牢再加液。二是组织块的大小，应该在1-2立方毫米为佳，太大就不容易贴壁，还有就是加的液体体积，初次加入的量不应过多，过几天再加液或者换液，这样组织可能会贴的牢固一些。

作者: deshenglll 时间: 2015-4-22 17:01

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这个不好说的。首先看脐带质量怎么样，其次是你的操作手法。要是脐带好的话，15到20瓶吧。置于培养基加多少你可以摸索，因为每个人剪的组织块大小有区别，所以不好说，一般情况下T75瓶加10ml。

作者: colins 时间: 2015-4-23 09:13

组织块大小控制在1-2立方毫米，换液时间等到7天后，细胞从组织内爬出来是需要很长时间的，期间不要移动培养皿。再就是你的培养基有没有问题，该加的因子、血清（或者替代物）是否都已经加了

作者: snowny007 时间: 2015-4-23 10:23

如果是不贴壁生长的话，有以下几点建议：组织块接种密度要适宜，不宜过大或过少；组织块大小对细胞爬出的影响不好区分，小个组织爬出的细胞会很快，但不易贴牢，大个的组织更容易贴住，但爬出的慢，个人经验组织在0-3cm之间均是可以的；另外初次培养液体量应该是以少量加入和长时间培养为宜，不宜早换液，全量换液和半量换液均可，个人推荐全量换液，因为全量换液后可以保证更长贴壁时间，我们用的培养基，细胞爬出时间都在第一次换液后，第二次换液前。

作者: 1233hyp 时间: 2015-4-23 11:22

个人认为：其一，是不是你脐带本身的问题，会不会放太久了？一般从采集到处理中间时间不超过24h内处理为好；其二，先把组织块撕细点再剪；其三，如果做贴壁的话，最好在剔除羊膜，静动脉后不要清洗，否则不容易贴壁；还有就是会不会培养基的问题。

作者: 水念人倦 时间: 2015-4-27 08:57

给楼主一些个人建议，个人觉得组织块2~5mm3是最好的，能贴住，换液也不会因为太小被冲起来。
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原代培养的时候加液的高度以即将浸没组织块为宜，然后放好了就不要碰了，换液时间可以再长一点，三天换液很有可能破坏微环境，有可能不利于生长。
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之前我个人做过几次对照，用的是75的瓶子原代培养，3天换液的加4ml，6天换液的加6ml，几组结果下来明显6天换液的细胞数量更多。5 G9 e: q" h8 p$ L' ]* S

希望对楼主有帮助吧~~

作者: chenlin080102 时间: 2015-4-29 21:33

我还是喜欢用酶解法，这样不用在前几天注意培养液液量，酶解法5天就能长出很多细胞，而且间距均匀，大大缩短收货的时间，半个月能收到第三代

作者: 维维睡啦 时间: 2015-5-5 13:08

不用倒置，第一次培养基添加量过少，如果是150瓶子，建议加10-15ml，前6-7尽量不要换液也不要动它，第6、7天变量换液，一般第6、7天就能观察出克隆出来的细胞了。前期培养要耐心。

作者: nkcell 时间: 2015-5-5 14:54

首先用的培养基有轻微的碱性，组织块剪好之后直接加到培养基中，放入培养皿中培养，五天之后换液，组织块基本就都贴了，再过两三天就会长出很多的细胞

作者: 听不到 时间: 2015-5-6 09:21

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能问下你酶解法是怎么做的吗?想加你好友或者留言之类的都没权限...

作者: 大少爷 时间: 2015-5-6 10:00

主要原因应该还是培养方法的问题，我们一般会去掉羊膜和血管，剪切成 1~4mm3的组织匀浆块，每T75瓶接种 0.5~0.6g ，9ml培养基，培养第 5~6 天进行全量换液（这期间不作处理），将培养瓶中的未贴壁的组织块和旧的培养基一起合并转移到 50ml 离心管，离心去上清，培养基再重悬，等量均分到原来的培养瓶，然后定容至 10ml/T75 培养瓶。全量换液时其实有好多组织块并未贴壁，不用担心，继续培养，正常情况在8天左右就会有细胞长出来，在11天左右进行一次半量换液（动作缓慢，吸7加10）即可，这样细胞增殖就很理想了。如果在11天左右换液时还是没有细胞，也不用担心，继续培养，15天左右再进行半量换液，继续观察和培养，期间尽量减少培养瓶的晃动。17天左右没有细胞长出来，估计就是其它问题（脐带问题的可能性很小），培养过正中尽量用新配制的培养基。3 v6 v; V7 `4 l8 }8 g7 e T$ n

作者: nkcell 时间: 2015-5-7 09:41

即使是放在培养基里也要放大约12天才能长满平皿，正常这12期间只需要换两次液体，加的液体以刚刚覆盖组织块为好

作者: 呵呵 时间: 2015-5-7 15:33

倒置时间有点短，我们一般倒置时间比较长。加也是梯度加，没你这么快和多。

作者: scarletkiki 时间: 2015-5-11 09:51

回复 hwlightning 的帖子' m2 a4 @% C, i7 }# O
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我用的10cm的dish, 贴组织的时候不要加太多液体，直接加2-3ml液体，只要把组织浸润就可以了，放置24-48h 后，再加3ml液体，直到72h后，再加到正常液体培养，7天后开始换液，可以看细胞爬出情况做半量换液

作者: edwardellen 时间: 2015-5-11 10:12

还要考虑你这一次用的组织是什么情况，还有你的血清和培养基的情况，如果组织不新鲜或者保存不当，或者血清存放太久等有问题，都会影响的。
另外就是和那个供体的关系也很大，我以前做过一个，那个脐带看着就不太健康，养了20多天才有细胞爬出来，出来细胞的状态也不好。" D( N' c5 \, Z m8 e, s+ B* w
如果能做酶消化，还是做酶消化吧，好歹直接能看到细胞。# v0 w. I, ^' y4 D
剪组织的时候不能有液体，有液体会降低胶质的粘附能力，一般剪到足够小，均匀的铺在板底，马上就放进培养箱，不用倒置，做完最后一盘，从第一盘开始加培养基。0 [: I! C- U. ^! z
加培养基的时候要注意缓慢，不要冲击组织，一般10cm的平皿，加8-10mL培养基，放进培养箱里就不要再动了，一周以后拿出来看，基本就能看到有细胞爬出来了。$ {; F/ r! \" D5 F. g/ w |

作者: 小跑 时间: 2015-5-11 10:25

我刚开始培养时也遇到和楼主类似的问题。前期买的培养基DMEM/F12加胎牛血清，买的国产某品牌胎牛血清，质量不好，怎么都培养不起来。后来换了无血清培养基套装，总算培养起来了。刚开始不能急，三天时间太短，细胞还几乎没有爬出来。组织块剪碎后不要洗，直接加液培养5天，期间不要动它，五天后再进行换液就行。看到有位前辈说换液时未贴壁的组织块及上清再次离心重悬，加入原瓶培养，我觉得是个不错的建议。酶解法确实比组织块法更快。

作者: hwlightning 时间: 2015-5-14 11:12

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大少，那个接种到T75培养瓶怎么做才能摆好，剪好的组织匀浆很难分成一块一块,还有不好粘液和气泡。1 K& m- Z. j1 z# t' }; S/ r0 h
还有个问题，不是所有组织块都能爬出细胞，有的组织块爬的快，有的慢，这样就只能根据爬的快的去传代培养吧！！！

作者: chenlin080102 时间: 2015-5-14 17:15

回复 hwlightning 的帖子2 m) f4 D( d9 L& i6 g! ^
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已发送至你邮箱，查收

作者: Ivan0108 时间: 2015-5-19 17:48

回复 chenlin080102 的帖子
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有好的方案也给我发一个，谢谢啦。我做的不知道什么原因，方法都差不多接种90mm培养皿，第六天全量换液，到第十二天的时候才勉强看到一个皿有两个组织爬出细胞来。（脐带采集下午4点，操作是第二天上午十点）

作者: alicia_86 时间: 2015-5-20 09:34

一般来说第7天就有细胞爬出来，12天还没爬出来肯能你剥离血管和羊膜的时候把华通氏胶也给剥离损耗了。如果一开始做技术不好可以不剥离羊膜不影响细胞爬出来和纯度。组织块接种后放置培养箱4-5h后再加液。我们75T的培养瓶就加5ml液。第4-5天换液。第6-7天就大量细胞爬出来。

作者: alicia_86 时间: 2015-5-20 09:35

一般来说第7天就有细胞爬出来，12天还没爬出来肯能你剥离血管和羊膜的时候把华通氏胶也给剥离损耗了。如果一开始做技术不好可以不剥离羊膜不影响细胞爬出来和纯度。1-3mm3的组织块接种后放置培养箱4-5h后再加液。我们75T的培养瓶就加5ml液。第4-5天换液。第6-7天就大量细胞爬出来。

作者: 791849046 时间: 2015-5-25 15:39

可以选择直接悬浮法来培养呀比贴壁法操作简单，每个培养皿里直接加入培养基10ml，3天半量换液，一般在一周之内就可以看到细胞贴壁了。

作者: cjsbaicai 时间: 2015-5-28 15:58

本帖最后由细胞海洋于 2015-5-29 16:42 编辑 7 i6 |) N0 F6 a7 x/ Y7 v
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楼主用的是物理分离方法，即让间充质干细胞从细胞块中自由爬出。但这种方法有以下几点需要主要：1. 组织块要足够的小；2. 种瓶的密度要合适；3. 倒置培养不一定是必须的。此外，少量组织块悬浮也是正常的现象; I9 ?: p1 [- J0 r8 ?! \) I) I
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作者: chrindy 时间: 2015-5-29 12:50

请问各位大侠，如果要把剪碎的组织块放进培养瓶里面，大家都怎么放的呢？？我用显微镊夹又觉得很容易把平底刮花细胞不好贴壁，用枪头吸又容易堵枪头...还想问一下我要是种25cm的培养瓶要放多少组织块呢？？生长因子大家都用2ng/ml的bFGF吗？？

作者: 细胞海洋 时间: 2015-5-29 17:12

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作者: chrindy 时间: 2015-5-30 13:14

回复细胞海洋的帖子) O" J3 n& X. z O1 z8 V1 |
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多谢提醒！

作者: lyj-0017 时间: 2017-4-18 14:03

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你好，同学！能否把你的酶消化方案分享一下？学习一下，谢谢咯

作者: 阿秀哥 时间: 2017-4-19 10:10

你换液的频率是不是有点太快了，一般脐带间充质干细胞都没那么快有细胞爬出来的

作者: Llxue 时间: 2017-4-21 10:12

建议楼主可以换成培养瓶试试，倒置过夜，可以加点培养基在倒置后的瓶里，第二天翻瓶时小心轻轻的将培养基浸过组织，保持它不干就行，过三天再半换液，一般7-14天会长出细胞，间充质原代培养要有耐心，细胞爬出的时间不定的

作者: wzs1985 时间: 2017-4-21 10:19

回复 hwlightning 的帖子$ \: A. O4 I3 `! {

想问问你们是用哪个公司的商业化培养基，一般扩增比率是多少？

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